肺结核病生物学标志物miRNAs筛

发布时间：2020-10-18 19:33

　　 第一部分血清miRNAs作为肺结核病新分子标志物的筛选与鉴定 研究背景：结核病(Tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)引起的慢性感染性疾病,可侵及许多脏器,以肺部结核(Pulmonary Tuberculosis, PTB)感染最为常见,占各器官结核病总数的80-90%,发展成为肺结核病。肺结核病是一种严重威胁人类健康的疾病之一。肺结核病防治最突出的难点是缺乏疾病特异性的早期诊断标志物,无法获得早期诊断,导致肺结核病高发和死亡率的上升。为此,迫切需要研究肺结核病特异生物学标志物,建立一种快速、敏感、高效的肺结核病诊断和鉴别的新方法,防止肺结核病蔓延。本研究从血清miRNAs的表达谱中,筛选能作为肺结核病生物标志物,建立血清miRNA组合物,作为临床诊断的潜在新分子标志物。 研究方法：本研究收集血清样本326例,其中健康对照者108例,肺结核病患者128例,鉴别诊断组疾病患者90例,包括肺癌、肺炎和慢性阻塞性病患者各30例。应用Solexa测序技术进行初步筛查,检测20例肺结核病患者和20例健康对照者中血清miRNAs;应用荧光定量PCR方法,在108例肺结核病患者、88例健康对照者,以及90例鉴别诊断组疾病患者血清样本中验证差异表达的血清miRNAs;通过ROC曲线和Logistic回归模型分析,对单个血清miRNAs和miRNAs组合对肺结核病诊断的灵敏度和特异性进行比较和分析；最后应用预测miRNAs调控的靶基因和全基因组转录概况,构建与肺结核病相关的靶基因和miRNAs的网络图。 研究结果：应用Solexa测序技术检测肺结核病患者和健康对照者的血清miRNAs,在肺结核病患者中,选择具有显著性差异的15个血清miRNAs,其中10个血清miRNAs表达量上调,5个血清miRNAs表达量下调；通过荧光定量PCR方法发现,在肺结核病患者和健康对照者中,有6个血清miRNAs (hsa-miR-378、 hsa-miR-483-5p、hsa-miR-22、hsa-miR-29c、hsa-miR-101和hsa-miR-320b)具有显著性差异(P0.001)。并且在肺结核患者和鉴别诊断组之间进行比较均具有显著性差异(P0.05)；通过对这6个血清miRNAs单个的ROC曲线进行分析,显示单个血清niRNAs的AUC在0.702到0.880之间；通过Logistic回归模型方法计算6个血清miRNAs组合物的AUC为0.982(95%CI,0.929-0.998),灵敏度为95.0%和特异性为91.8%。MiRNAs-Gene网络结构图显示miRNAs可能是调控机体的免疫通路相关基因,参与肺结核病的发生过程。 结论：(1)建立Solexa测序技术结合qRT-PCR检测技术,可快速稳定灵敏地构建肺结核血清miRNAs指纹图谱检测技术；(2)筛选了肺结核病相关特异的6个血清miRNAs,为建立肺结核病临床早期快速特异诊断的标准,提高肺结核病的防治水平奠定基础；(3)鉴定和构建血清miRNAs组合可能是肺结核病的诊断潜在的新分子标志物,为进一步研究miRNAs在肺结核病中的致病机制奠定基础。 第二部分Mir-146a, miR-149, miR-196a2和miR-499SNPs与中国维吾尔族、哈萨克族和南方汉族人群肺结核病易感性的研究 研究目的：MiRNAs是一类非编码RNA,以mRNA为靶标并抑制mRNA表达蛋白。单核苷酸多态性发生在miRNAs的前体中,通过影响miRNAs的表达或者成熟导致其正常功能的发挥,并且可能通过修饰miRNAs调控影响表型类型和疾病易感性。人类miRNAs基因中的数个SNP可能影响miRNAs的生物合成和功能,可能参与肺结核病的发生机制。本实验首次研究miR-146a C﹥G、miR-149T﹥C、miR-196a2T﹥C和miR-499A﹥G SNPs位点与中国维吾尔族、哈萨克族和南方汉族人群肺结核病易感性,揭示这4个miRNAs SNPs位点基因可能是肺结核病的候选易感基因。 研究方法：应用PCR-PFLR方法分析SNPs的分布频率。本研究共收集654例南方汉族人群血样(健康对照组300例,肺结核病组354例)、662例维吾尔族人群血样(健康对照组361例,肺结核病组301例)和612例哈萨克族人群血样(健康对照组361例,肺结核病组251例)。对基因型及基因频率分布进行检测,并对遗传模式和连锁不平衡进行分析。 研究结果：在维吾尔族人群中miR-499A﹥G SNP位点的等位基因A(P=0.003； OR=1.563;95%CI,1.162-2.103)和基因型GG型(P=0.001; OR=5.344；95%CI,1.803-15.83)在肺结核病组和健康对照组之间存在显著性差异；在年龄和性别校正后,发现miR-499A﹥G SNP位点在共显性(P=0.0014；OR=5.37；95%CI,1.81-15.92)、显性(P=0.029；OR=1.47；95%CI,1.04-2.09)、隐性(P=7e-04；OR=4.95；95%CI,1.68-14.55)和加性模式(P=0.0027; OR=1.57；95%CI,1.16-2.11)下与肺结核病存在显著相关性；连锁不平衡分析,发现构建的单体型CTCC与肺结核病的发生具有显著相关性(P=0.044; OR=7.19；95%CI,1.01-51.14); MiR-146a C﹥G、miR-149T﹥C和miR-196a2T﹥C SNPs位点的等位基因频率和基因型在肺结核病组和健康对照组之间的分布均无显著性差异(P0.05)。在哈萨克族人群中,miR-146a C﹥G位点的等位基因G (P=0.023；OR=1.33;95%CI,1.04-1.69)和CC型(P=O.013；OR=1.84；95%CI,1.14-2.98)在两组之间存在显著性差异；同时miR-196a2T﹥C SNP位点的等位基因C(P=0.008；OR=O.73；95%CI,0.58.0.92)和基因型TT型(P=0.013；OR=0.54；95%CI,0.33-0.88)在两组之间存在显著性差异；经年龄和性别校正后,发现miR-146a C﹥G SNP位点在共显性(P=0.019；OR=1.87；95%CI,1.15-3.03)、隐性(P=0.005；OR=1.84；95%CI,1.20-2.81)和加性模式(P=0.022；OR=1.33；95%CI,1.04-1.69)下与肺结核病存在显著相关性；miR-196a2T﹥C SNP位点在共显性(P=O.029；OR=0.54；95%CI,0.33-0.88)、显性(P=0.014；OR=0.65；95%CI,0.46-0.92)和加性模式(P=0.0083；OR=0.73；95%CI,0.58-0.92)下与肺结核病存在显著相关性；miR-149T﹥C和miR-499A﹥G SNPs位点的基因型频率在健康对照组与肺结核病组之间的分布均无显著性差异(P0.05)。在南方汉族人群中,构建的单体型TCCC (P=0.044; OR=0.23；95%CI,0.05-0.96)和CCCT(P=0.024；OR=0.03；95%CI,0.01-0.63)与肺结核病的保护效应具有显著相关性。 结论：(1)利用病例-对照方法,结合统计学分析,首次对miR-499A﹥G、 miR-146a C﹥G、miR-149T﹥C和miR-196a2T﹥C SNPs位点与中国维吾尔族、哈萨克族和南方汉族人群结核病的易感性进行关联研究；(2) miR-499A﹥G SNP位点与维吾尔族人群肺结核病的易感性相关,可能增加肺结核病的发生风险；miR-146a C﹥G、 miR-149T﹥C和miR-196a2T﹥C SNPs与维吾尔族人群肺结核病的不存在相关性；(3) miR-146a C﹥G和miR-196a2T﹥C SNPs位点与哈萨克族人群肺结核病发生的相关；miR-149T﹥C和miR-499A﹥G SNPs与哈萨克族人群肺结核病的不存在相关性；(4) miR-146a C﹥G、miR-149T﹥C、 miR-196a2TC和miR-499A﹥G SNPs位点与中国南方汉族肺结核病易感不存在相关性。提示miRNA SNPs与肺结核易感具有种族差异性。 第三部分在中国维吾尔族、哈萨克族和南方汉族人群中的MRCl基因多态性与肺结核病易感性的研究 研究背景：机体识别结核分枝杆菌并介导免疫应答主要依赖T淋巴细胞、巨噬细胞和树突状细胞等固有免疫细胞表面的模式识别受体(Pattern Recognition Receptors, PRRs)。 MRC1基因编码的PRRs家族的甘露糖受体,属于C型凝集素超家族成员,可通过胞外区识别和结合结核分枝杆菌、递呈抗原和保持内环境稳定中发挥作用。目前尚没有MRC1基因SNPs与结核病易感性报道。本实验研究中国新疆地区维吾尔族、哈萨克族和南方汉族人群MRC1基因第7号外显子基因多态性与肺结核病易感性,揭示MRC1基因可能是肺结核病的候选易感基因。 研究方法：应用PCR和DNA测序技术,对中国新疆地区595例维吾尔族人群血样(健康对照组345例,肺结核病组250例)、513例哈萨克族人群血样(健康对照组325例,肺结核病组188例)和454例南方汉族人群血样(健康对照组226例,肺结核病组230例)MRC1基因第7号外显子的6个单核苷酸多态性(G1186A、G1195A、T1212C、C1221G、C1303T和C1323T)基因型及基因频率分布进行检测,并对6个位点进行连锁不平衡分析。 研究结果：研究发现在维吾尔族人群中MRC1基因的G1186A位点的等位基因G的分布频率在肺结核病组(0.464)中低于健康对照组(0.536),并且在维吾尔族肺结核病组和健康对照组之间的分布具有显著性差异(P=0.029；OR=1.29；95%CI,1.02-1.63)；基因型分析发现MRCl基因的G1186A位点基因型AA型在肺结核病组的频率低于健康组,在两组之间也存在显著性差异(P=0.037；OR=1.66；95%CI,1.05-2.61)；在年龄和性别校正后,MRC1基因的G1186A位点在加性模式下与肺结核病存在相关性(P=0.039；OR=1.27；95%CI,1.01-1.60)。从MRC1基因SNPs位点的连锁不平衡分析,发现构建的GGTCCT单体型(P=0.034；OR=0.75；95%CI,0.57-0.98)和GGTCCC单体型(P=0.043；OR=0.57;95%CI,0.33-0.98)与肺结核病存在显著的相关性,其余5个SNP位点(G1195A、T1212C、 C1221G、C1303T和C1323T)与肺结核病的易感性不存在显著相关性(P0.05)。在哈萨克族人群中发现MRCl基因的6个SNPs位点的等位基因频率和基因型频率在肺结核病组和健康对照组之间的分布均无显著性差异(P0.05)。在汉族人群中MRCl基因的G1186A等位基因G的分布频率在肺结核病组中高于正常健康组,两组间分布存在显著差异(P=0.023；OR:0.76；95%CI,0.57-0.95)。基因型分析也表明该位点的AG型在汉族人群正常健康组与肺结核病存在显著相关性(P=0.0076; OR=0.55；95%CI,0.36-0.85)。在年龄和性别校正后,G1186A位点在显性(P=0.0057；OR=0.57；95%CI,0.38-0.85)、超显性(P=0.039；0R=0.68;95%CI,0.47-0.98)和加性模式(P=0.03；OR=0.75;95%CI,0.58-0.97)下,与肺结核病存在显著相关性。而其它5个SNP位点(G1195A、T1212C、C1221G、C1303T和C1323T)与肺结核病无相关性(P0.05) 结论：(1)利用病例-对照方法,结合统计学分析,首次对MRCl基因第7号外显子区域的6个SNPs位点与中国维吾尔族、哈萨克族和南方汉族人群结核病的易感性进行关联研究；(2)MRC1基因的G1186A位点与维吾尔族人群肺结核病的易感性相关,可能增加肺结核病发病率；可能是南方汉族人群肺结核的保护因子,并且可能减少中国汉族人群感染肺结核病的风险；与哈萨克族肺结核病的易感性没有关联；(3)MRC1基因的G1195A、T1212C、C1221G、C1303T和C1323T SNPs与中国维吾尔族、哈萨克族和南方汉族肺结核病均不存在显著的相关性。结果表明,肺结核病的易感性可能与遗传因素造成的个体差异密切相关,同时为阐明中国人群肺结核病的发病机制,提供了新的实验依据。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R521
【文章目录】：
致谢
基金资助
摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分 血清miRNAs作为肺结核病新分子标志物的筛选与鉴定
    1 前言
    2 材料
    3 方法
    4 结果
    5 讨论
    6 结论
第二部分 MiR-146a,miR-149,miR-196a2和miR-499 SNPs与中国维吾尔族、哈萨克族和南方汉族人群肺结核病易感性的关联研究
    7 前言
    8 材料
    9 方法
    10 结果
    11 讨论
    12 结论
第三部分 在中国维吾尔族、哈萨克族和南方汉族人群中的MRCl基因多态性与肺结核病易感性的研究
    13 前言
    14 材料
    15 方法
    16 结果
    17 讨论
    18 结论
参考文献
综述
    参考文献
作者简历及在读期间所取得的科研成果

【参考文献】

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本文编号：2846717