家蝇抗菌肽Cecropin抗HBV作用机制研究

发布时间：2020-10-29 14:06

　　 研究目的:拟根据HBV(Hepatitis B virus,HBV)感染细胞的关键事件,探讨家蝇抗菌肽Cecropin(Musca domestica cecropin,MDC)抗HBV感染作用机制;外泌体作为细胞间交流的新方式,可携带病毒感染相关生物学信息,对病毒感染最终的结局有着重要的影响,本实验旨在探索HepG2.2.15细胞上清来源的外泌体是否介导HBV感染,MDC是否干预外泌体介导的HBV感染过程。研究方法:1.家蝇抗菌肽Cecropin抗HBV作用机制研究:(1)Hi-Trap肝素亲和层析柱法纯化HBV颗粒;电镜负染观察HBV形态。(2)MTT实验检测药物对HepaRG细胞增殖影响;12天感染实验中利用Real-time PCR实验检测MDC对HBV黏附/进入及进入后阶段的影响;激光共聚焦显微镜及流式细胞术检测HBV黏附细胞阶段加入药物对感染率的影响;MTT实验检测药物对HepG2.2.15细胞毒性作用,Real-time PCR、ELISA、激光共聚焦显微镜及Western blotting检测MDC对HepG2.2.15细胞内HBV复制的影响。(3)激光共聚焦显微镜观察MDC在细胞内分布及定位;Real-time PCR、Western blotting检测MDC对JAK/STAT信号通路的影响。2、家蝇抗菌肽Cecropin抑制外泌体介导的HBV感染作用研究:(1)试剂盒提取HepG2.2.15细胞上清中外泌体(HepG2.2.15-EXO);电镜负染检测外泌体形态,纳米颗粒跟踪分析仪检测外泌体粒径,Western blotting检测外泌体标志性蛋白,PCR技术检测外泌体是否含HBV核酸成分;超高分辨率活细胞3D显微成像仪观察外泌体在细胞内的定位;(2)流式细胞术检测外泌体在细胞中的扩散与传递,ELISA,Real-time PCR,ICC,Western blotting检测HepG2.2.15-EXO是否介导HBV的感染,及探讨MDC是否干预外泌体介导的HBV感染;(3)流式细胞术检测外泌体浓度、共同孵育时间温度、肝素及肝素酶对外泌体在细胞间扩散传递的影响;Real-time PCR检测肝素及肝素酶对细胞内HBV-DNA的表达影响;研究结果:1、家蝇抗菌肽Cecropin抗HBV作用机制研究:(1)电镜观察显示MDC作用后HBV颗粒结构破坏,并发生凝集反应;(2)在HBV攻击细胞前或后加入药物干预,结果显示MDC能使细胞HBV相关指标(细胞内HBV-DNA,HBVcccDNA,pgRNA含量)降低,在HBV的黏附/进入及进入后阶段均发挥了抑制作用;MDC可显著降低HepG2.2.15细胞上清中HBsAg、HBeAg抗原及HBV DNA含量,细胞内HBsAg、HBcAg蛋白含量,具有抑制HBV复制作用。(3)激光共聚焦显微镜观察显示MDC作用位点主要在细胞膜,细胞质及细胞核也有结合;且MDC能激活JAK/STAT抗病毒信号通路,发挥抗病毒作用。2、家蝇抗菌肽Cecropin抑制外泌体介导的HBV感染作用研究:(1)对试剂盒法提取的外泌体,进行电镜形态学检测,纳米颗粒跟踪技术的粒径检测,及外泌体标志性蛋白检测,确定提取的为外泌体,可以进行后续实验;PCR技术核酸检测显示外泌体中存在HBV核酸;(2)流式细胞术、ELISA、ICC、Western blotting及Real-time PCR实验结果显示经外泌体共同孵育的正常肝细胞HBV呈阳性表达,而家蝇抗菌肽Cecropin作用后,上述细胞内HBV相关指标的表达显著降低;(3)外泌体浓度、共同孵育时间、共同孵育温度、肝素、肝素酶对外泌体在细胞间扩散传递有一定影响。结论:家蝇抗菌肽Cecropin可破坏HBV病毒颗粒结构,并使其发生凝聚;此外其对HBV病毒生命周期中的黏附/进入阶段及进入后的复制阶段均有抑制作用;MDC可通过激活抗病毒信号通路,发挥其抗病毒作用;提示MDC抗HBV作用机制复杂,涉及多个靶点;此外HepG2.2.15细胞上清来源的外泌体可介导HBV感染,而MDC对外泌体介导的HBV感染具有显著抑制作用。
【学位单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R512.62
【部分图文】：

图 1-1 HBV 生命周期图1.1.2 外泌体外泌体是一种可以由大多数细胞所分泌的，直径约为 30-150 nm 的微小囊泡，其表面结构富含脂类物质，其内可携带多种核酸、蛋白质等生物信息[20-21]。外泌体穿梭在细胞与细胞间，扮演着物质运输与信息交流的作用，参与到多种生理学及病理学过程，如细胞生长增殖分化，调节免疫反应及疾病细胞间物质运输等[22-23]。有研究报道，外泌体在肝脏疾病中也发挥着重要作用[24-25]。在肝脏疾病的发生发展过程中，外泌体所携带的相关核酸、蛋白等成分也发生相应的改变，因此，外泌体在肝脏疾病进程中也有望被用作生物标记物，来指导肝脏疾病的诊断治疗[26]。其发挥交流沟通的机制可能是外泌体与靶细胞相关受体结合、内含物改变受体细胞微环境、最终调节细胞的生理进程。因此加强对细胞外排的外泌体的探讨，对进一步了解原分泌细胞的生物学活性及指导疾病诊断治疗有重要意义[27]。外泌体由原细胞分泌释放到外环境中，通过各种途径被靶细胞所吸收，这个过程并非随机发生，细胞特异性是否参与到其中的特异性吸收过程，也仍是研究的一个方向[28]。

广东药科大学硕士研究生学位论文结果蝇抗菌肽 Cecropin 直接作用于病毒颗粒集 HepG2.2.15 细胞培养过程中的细胞上清，每 100 mL 上清按操，纯化过程及定量结果分别见图 2-2、表 2-1。HBV 颗粒与浓度为菌肽 Cecropin（MDC）直接作用后，病毒颗粒的形态变化如图 2，HBV 颗粒表面结构遭到破坏，并且家蝇抗菌肽 Cecropin 处理组。

广东药科大学硕士研究生学位论文原细胞上清 肝素管纯化液 第一次超滤液 第二次超滤液1 M NaCl 20 mMTris-HCl 第二管1 M NaCl 20 mMTris-HCl 第二管1 M NaCl 20 mMTris-HCl 第二管体积 100 mL 50 mL 1.8 mL 0.8 mLHBVcopies/μl1912 200.2 158.4 稀释 10 倍后为 502.41 M NaCl 20 mMTris-HCl 第一三管1 M NaCl 20 mMTris-HCl 第一三管1 M NaCl 20 mMTris-HCl 第一三管体积 100 mL 5.8 mL 1.2 mLHBVcopies/μl135.2 901.3 稀释 10 倍后为 743
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本文编号：2861006