转录因子NRF2在巨噬细胞感染结核分枝杆菌自噬中的作用研究

发布时间：2020-11-04 17:31

　　 研究背景:自噬作为一种细胞免疫防御机制受到广泛关注和研究。自噬与针对结核分枝杆菌的先天性和适应性免疫应答相关,其可通过参与调控溶酶体与吞噬体的融合,以及吞噬溶酶体的成熟过程,影响巨噬细胞对细菌的杀伤。有研究表明转录因子NRF2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,NRF2)通过调节ROS的产生,参与巨噬细胞对感染结核分枝杆菌的杀伤。本研究旨在进一步探讨转录因子NRF2在巨噬细胞感染结核分枝杆菌自噬中的作用及其机制。方法:(1)通过RNA-seq技术对结核病人和健康人外周血中PBMC的线性RNA测序来检测NRF2的基因表达。然后利用实时荧光定量PCR(real-time quantitive PCR,q-PCR)技术对结核病人和健康人的外周血中PBMC的NRF2的测序结果进行验证。(2)建立由PMA(phorbol ester,佛波醇)诱导的M.tb感染THP-1来源巨噬细胞THP-1(a)模型。通过流式细胞分析仪和荧光显微镜检测活性氧物质(reactive oxygen species,ROS)的变化水平;(3)利用q-PCR技术,检测M.tb感染巨噬细胞后,细胞内的NRF2和抗氧化物SOD-1、SOD-4、PPARA、NOX-1的基因转录水平;(3)利用蛋白质印迹(Western Blot,WB)检测M.tb感染巨噬细胞2h,4h,6h,12h和24h后NRF2和自噬相关蛋白(Beclin-1,Atg-12,Atg-7,Atg-5,Atg-3,LC-3)的表达水平。(4)再利用WB检测M.tb感染Brusatol预处理THP-1(a)后的NRF2和自噬相关蛋白(Beclin-1,Atg-12,Atg-7,Atg-5,Atg-3,LC-3)的表达水平。结果:(1)RNA-seq测序结果显示:与健康对照组相比,隐性结核病患者(LTB)NRF2线性RNA表达水平显著降低(p0.01),活动性结核病患者(TB)轻度增高;q-PCR的结果表明,结核病人NRF2表达水平相对于健康人也呈现轻度增高趋势;(2)M.tb感染巨噬细胞组与未感染组相比较ROS产生水平水平显著升高(p0.01);(3)M.tb感染THP-1(a)后,相对于THP-1(a)对照组,感染组细胞NRF2,SOD-4,SOD-1以及PPARA基因在转录水平都出现了不同程度的增高,其中SOD-4,SOD-1,PPARA表达水平差异具有统计学意义(p0.05或P0.01,n=3);(4)M.tb感染THP-1(a)6h前后,NRF2以及自噬相关蛋白(BECLIN-1,Atg-12,Atg-7,Atg-5,Atg-3,LC3)表达水平达到峰值;(5)Brusatol阻断NRF2活化后,M.tb感染THP-1(a)组的自噬相关蛋白(Beclin-1,Atg-12,Atg-7,Atg-5,Atg-3,LC3)的蛋白表达水平显著降低。结论:1.结核分枝杆菌感染对转录因子NRF2表达水平和活性有重要影响;2.NRF2通过调控胞内ROS水平影响巨噬细胞对感染结核分枝杆菌的自噬。
【学位单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R52
【部分图文】：

24 例、隐性结核病患者 13 例和健康对照 31 例，著性差异（p<0.01）（表 1）。表 1 RNA-seq 测序样本年龄比较组 别年龄( )组（31） 41±12B （13） 20±1组（24） 29±9分析结核病患者、隐性结核病患者和健康对照组表达水平，结果显示：与健康对照组相比，隐性结核 表达水平显著降低（p<0.01），活动性结核病患差异（p>0.01）（图 1）。x ±s

病人升高显著（p<0.01,n=4），但在年轻组初治结核病人4），如图 2：表 1：结核病人和健康对照标本信息表本号 年龄（y） 性别h-7 9 男h-14 58 男h-18 64 男h-19 26 男C-1 29 男C-1 49 男C-3 67 男C-4 49 女

3.4 M.tb 感染巨噬细胞 ROS 水平检测结果图 A-F 分别为 THP-1（a）对照组，M.tb 感染 THP-1（a）细胞 30min，2h，4h，6h，10h 组的巨噬细胞内 ROS 的变化水平（图 4A~F）；图 4 G 为各组平均荧光强度的统计图，我们可以发现，M.tb 感染巨噬细胞 30min 后就出现了 ROS 的激活，而随后的 2h，4h，6h，10h 的 M.tb 的感染一直使巨噬细胞处于氧化应激的状态。
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本文编号：2870391