念珠菌影响巨噬细胞固有免疫反应及自噬的效应与机制的初步研究

发布时间：2020-11-06 14:58

　　 念珠菌是侵袭性真菌感染的最常见致病菌,单核-巨噬细胞是参与机体固有免疫反应的重要细胞。本文探讨了巨噬细胞在机体针对念珠菌的免疫反应中所发挥的作用,主要分两大部分。首先,通过建立小鼠腹腔白念珠菌感染模型,发现与其他免疫细胞相比,巨噬细胞吞噬白念珠菌的比例最高,说明在白念珠菌感染后巨噬细胞是持续存在的、最主要的吞噬细胞。通过为小鼠静脉注射氯膦酸二钠脂质体(Clodronate liposomes),建立清除巨噬细胞的小鼠模型,发现清除巨噬细胞的小鼠白念珠菌系统感染后体重明显减轻,死亡率明显增加,提示了巨噬细胞在抗念珠菌感染中的核心地位。树突细胞相关C型凝集素1(Dectin-1)是一种能够特异性识别白念珠菌胞壁成分β-葡聚糖的模式识别受体;通过转染特异性siRNA的方法干扰Dectin-1受体的表达,给予荧光标记的白念珠菌孢子诱导THP-1巨噬样细胞,以荧光显微镜、流式细胞仪两种方法检测对白念珠菌的吞噬情况,发现转染siRNA-Dectin-1后细胞对白念珠菌的吞噬水平明显降低,说明Dectin-1受体在巨噬细胞对白念珠菌的吞噬效应中发挥重要作用。近些年来由非白念珠菌感染致病的情况逐渐增多,特别是近平滑念珠菌、热带念珠菌临床致病较高;因此,本研究关注了近平滑念珠菌、热带念珠菌所诱导巨噬细胞的炎症反应。THP-1巨噬样细胞给予近平滑念珠菌、热带念珠菌体外诱导,通过q-PCR、ELISA两种方法检测,发现其均可诱导促炎症因子(TNF-α、IL-6)表达及分泌水平的增加,并呈现剂量、时间依赖效应;通过western blotting、共聚焦显微镜证明p38MAPK、ERK1/2MAPK、NF-κB等信号分子被激活,且流式细胞仪检测发现Dectin-1受体表达上调,证明其参与炎症反应。本研究的第二部分关注了白念珠菌对巨噬细胞自噬的影响。以THP-1巨噬样细胞、RAW 264.7细胞为研究对象,通过白念珠菌刺激联合多种溶酶体抑制剂,包括E-64d+pepstatin、氯喹(CQ)、氯化铵(NH4Cl)及巴弗洛霉素-A1(BAF-A1),western blotting检测发现白念珠菌可以降低LC3-I型向LC3-II型的转换,丫啶橙(AO)染色荧光观察发现白念珠菌的吞噬使巨噬细胞内自噬溶酶体的形成减少,说明白念珠菌感染降低巨噬细胞的基础自噬流水平。同时,通过转染GFP-LC3、RFP-GFP-LC3杆状病毒来荧光标记细胞内LC3的分布,发现LC3可被募集到白念珠菌孢子周围,参与对白念珠菌的吞噬过程。通过分析白念珠菌、LC3、吞噬关键分子Rubicon、溶酶体的共定位关系,验证了 LC3相关吞噬(LAP)的存在;且白念珠菌的处理会导致LC3的募集,而不伴自噬流的关键分子p62、ATG9A的共定位,证明了白念珠菌被巨噬细胞吞噬的过程主要发生LAP,而非形成自噬小体。为探索白念珠菌抑制巨噬细胞基础自噬流的分子机制,本研究通过白念珠菌联合雷帕霉素、Torin 1、pp242等MTOR抑制剂体外诱导THP-1巨噬样细胞,western blotting检测MTOR通路磷酸化水平的变化,发现白念珠菌通过非MTOR依赖途径减低巨噬细胞的自噬流水平;然而,白念珠菌重要的胞壁成分β-glucan的诱导可增加THP-1巨噬样细胞的基础自噬流。我们推断,吞噬白念珠菌后基础自噬流减低的效应可能与LAP发生时对LC3的占用相关。我们还探讨了白念珠菌减低自噬流的效应对巨噬细胞DNA合成、增殖、凋亡、活性氧产生的影响,并发现白念珠菌诱导除抑制自噬流外,还会导致明显的DNA合成的抑制,但对细胞凋亡、增殖水平无明显影响。白念珠菌诱导可导致活性氧产生增加;然而,通过药物增加自噬水平后并不影响白念珠菌对活性氧诱导的水平。自噬在巨噬细胞抗念珠菌免疫反应中的作用仍有待继续研究。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R756
【部分图文】：

３）?ＰＢＳ?ｌｉｐｏｓｏｍｅ＋ＳＣ５３１４?组：ｄ－１、ｄｌ?静脉注射?ＰＢＳ?ｌｉｐｏｓｏｍｅ?２０（＾Ｌ／ｍｏｕｓｅ；?ｄＯ?静??脉注射?ＳＣ５３１４?ｌｘｌ〇６ＣＦＵ／ｍｏｕｓｅ〇??４）?Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ?ｌｉｐｏｓｏｍｅ＋ＳＣ５３１４?组：ｄ－１、ｄｌ?静脉注射?Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ?ｌｉｐｏｓｏｍｅ??２００（ａＬ／ｍｏｕｓｅ；?ｄＯ?静脉注射?ＳＣ５３１４?ｌｘｌ〇６ＣＦＵ／ｍｏｕｓｅ。??２．观察小鼠状态，每日固定时间称重，记录小鼠存活情况，小鼠存活率＝（小鼠总??数一死亡小鼠数）／小鼠总数ｘｌＯＯ％。??结果??一．小鼠白念珠菌腹腔感染模型中不同免疫细胞的吞噬作用比较??小鼠腹腔注射荧光标记的白念珠菌（荧光标记不影响白念珠菌活力）不同时间??点后，分析腹腔细胞内吞噬白念珠菌的各种细胞成分比例的变化。发现随着感染时??间的延长，巨噬细胞吞噬白念珠菌的比例逐渐增高，在４小时后持续为数量最高的??细胞（图１），说明了在白念珠菌局部感染后，巨噬细胞是持续存在的、最主要的免??疫细胞。??＾１〇°＂???Ｍａｃｒｏｈａｅ??

?０．００１）。而中性粒细胞的比例在不同小鼠组间无明显变化，差异无统计学意义，见??图３。??＿?＿?＊＊＊??６〇－｜?Ｉ?１??ＩＳ?＿??２?３〇－?■?Ｉ??Ｓ?２０＿圍與ｓ??＾?１０?丄??〇?Ｉ剩?Ｉ＝ｉ?Ｉ?＿＿?＊?＿＿??ｈ?＾?ＥＳ３?＝?麵?隱?ＰＢＳ??ｉ?２：?＿?＿?■丨?＊＊?Ｉ?圓翏?Ｅ３３?ＰＢＳ－ｌｉｐｏｓｏｍｅ??ｑＩ?ｉｌ＾?ｔｓｓａ?ｐｍ?—?ＥｘＳａ?ＥＳ３?国?Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ－ｌｉｐｏｓｏｍｅ??＼ｂｄｏｍｉｎａｌ?ｃａｖｉｔｙ?Ｌｙｍｐｈ?ｎｏｄｅ?Ｓｐｌｅｅｎ??图２小鼠注射ｌｉｐｏｓｏｍｅ后不同器官的巨噬细胞比例变化（＊＊户＜０．０１；?＊＊＊Ｐ＜０．００１）??ＮＳ??８－１?Ｉ?１??一?工??｜?６－?兩??！４＇?議圖＿?＿?Ｑ??＝２＿?＿?ＮＳ?圖?Ｅ：ｓ３?■?园?ＰＢＳ??ｚ?幽肉圉?＇?１?纏陶国?ｍ?ＰＢＳ－ｌｉｐｏｓｏｍｅ??圉應圍＠圍?ｓ?Ｃｌｏｄｒｏｎａｔｅ－ｌｉｐｏｓｏｍｅ??Ａｂｄｏｍｉｎａｌ?ｃａｖｉｔｙ?Ｌｙｍｐｈ?ｎｏｄｅ?Ｓｐｌｅｅｎ??图３小鼠注射ｌｉｐｏｓｏｍｅ后不同器官的中性粒细胞比例变化（ＮＳ：无差异）??三．小鼠系统感染白念珠菌菌株Ｃ１Ｍ、ＳＣ５３１４后体重变化情况??小鼠分组后分别静脉注射白念珠菌菌株Ｃ１Ｍ、ＳＣ５３１４孢子ｌｘｌ〇６ＣＦＵ／ｍｏｕｓｅ，??检测每组小鼠的体重变化，体重曲线见图４。可见白念珠菌菌株ＳＣ５３１４的毒力程??度明显强于Ｃ１Ｍ。后续实验将使用这两种毒力不同的白念珠菌菌株来确定小鼠清除??巨噬

三．小鼠系统感染白念珠菌菌株Ｃ１Ｍ、ＳＣ５３１４后体重变化情况??小鼠分组后分别静脉注射白念珠菌菌株Ｃ１Ｍ、ＳＣ５３１４孢子ｌｘｌ〇６ＣＦＵ／ｍｏｕｓｅ，??检测每组小鼠的体重变化，体重曲线见图４。可见白念珠菌菌株ＳＣ５３１４的毒力程??度明显强于Ｃ１Ｍ。后续实验将使用这两种毒力不同的白念珠菌菌株来确定小鼠清除??巨噬
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本文编号：2873290