吉西他滨促进HepG2.2.15细胞系中乙肝病毒pgRNA转录和病毒复制及相关分子机制研究

发布时间：2020-11-09 05:21

　　 目的:探讨吉西他滨对HepG2.2.15细胞中乙肝病毒前基因组RNA(pregenomic RNA,pgRNA)转录以及乙肝病毒复制的影响及其可能的作用机制。方法:使用不同浓度吉西他滨处理HepG2.2.15细胞,分别使用CCK-8法、流式细胞术、实时定量聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)法检测细胞活性、细胞凋亡、细胞周期、细胞内乙肝病毒pgRNA、细胞培养上清液中乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)、乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)、乙肝病毒DNA(hepatitis B virus DNA,HBV DNA);实时定量PCR法检测吉西他滨作用下HepG2.2.15细胞中与pgRNA转录有关的调控基因肝细胞核因子4α(hepatocyte nuclear factor4,HNF4α)、P38蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinase,P38MAPK)、环磷酸腺苷效应元件结合蛋白1(CAMP responsive element binding protein 1,CREB1)、核转录因子p65(nuclear factor-kappa B p65,NF-κb p65)、组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1,HDAC1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha,PGC-1α)、叉头转录因子O1(forkhead box protein O1,FOXO1)、相关调控基因沉默信息调节因子2相关酶1(sirtuin 1,SIRT1)、P53 mRNA水平以及pgRNA的表达量,分析这些基因随吉西他滨浓度变化与pgRNA随浓度变化的相关性,找出与pgRNA变化相关性最高的基因,并使用Western blot在蛋白质水平验证吉西他滨对此基因蛋白质表达量的影响。结果:吉西他滨对HepG2.2.15细胞的生长显示出浓度以及剂量依赖性的抑制作用;吉西他滨使细胞凋亡率增高;吉西他滨使细胞更多的细胞停滞在G_0G_1期,而处于S期细胞比例降低;吉西他滨明显增加HepG2.2.15细胞内乙肝病毒pgRNA,72 h之内呈现明显的时间与剂量依赖性;吉西他滨作用细胞24 h会使细胞培养上清液中的HBeAg增加;吉西他滨促进HNF4αmRNA、HNF4α蛋白质表达量增加,且在所检测的与乙肝病毒转录调节有关的基因中,HNF4αmRNA变化趋势与HBV pgRNA变化趋势相关性最高。结论:吉西他滨可在细胞水平促进乙肝病毒pgRNA转录以及乙肝病毒的复制,其机制为通过促进乙肝病毒转录因子HNF4α的表达实现的。
【部分图文】：

24、48、72 h时吉西他滨明显增加HepG2.2.15细胞中的乙肝病毒pgRNA（与各自的对照组相比，24 h时2、20、50μmol/L吉西他滨组的P值分别为0.005、0.001、0.006;48 h时P值分别为0.004、0.000、0.024;72 h时P值分别为0.003、0.003、0.001），吉西他滨导致的乙肝病毒pgRNA的增加呈明显的时间以及剂量依赖性。当药物作用于HepG2.2.15细胞96 h，乙肝病毒pgRNA增加的幅度不再明显（P值分别为0.026、0.117、0.092），增加幅度在96 h时无时间依赖性（表5、图1）。2.6 吉西他滨对乙肝病毒pgRNA相关的转录调控因子m RNA的影响以及各基因m RNA变化与pg RNA变化的相关性分析

不同浓度的吉西他滨作用于HepG2.2.15细胞48 h，检测乙肝病毒pgRNA以及各pgRNA转录调控基因mRNA的表达量，使用相邻两浓度乙肝病毒pgRNA表达量的差值、各相关调控基因mRNA表达量的差值进行相关性分析。结果显示（图2、图3、图4），在所有3个途径的9个与pgRNA的转录调控相关的基因中，随着吉西他滨浓度的变化，HNF4αmRNA的变化趋势与pgRNA的变化趋势相关性最高（r=0.934,P=0.020），其余基因mRNA变化趋势与pgRNA变化趋势相关性不显著（均P>0.05）。2.7 吉西他滨对HepG2.2.15细胞中HNF4α蛋白表达量的影响

除最大浓度的100μmol/L外，与对照组相比，所有浓度的吉西他滨均会导致HepG2.2.15细胞中HNF4α蛋白的表达量增加（表7、图5）。图4 途径三（去乙酰化酶HDAC1、SIRT1途径）mRNA变化趋势与pgRNA变化趋势的相关性
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