目的丙戊酸(Valproic Acid,VPA)作为一种经典的抗癫痫药物被广泛应用于临床,它同时还具有抑制细胞凋亡、减轻炎性反应、保护及营养神经元、减少胶质细胞增生等神经保护作用。脑型疟(Cerebral Malaria,CM)是恶性疟疾最严重的并发症,是疟疾患者死亡的主要原因,CM幸存患者有严重的神经系统后遗症。近年来,抗疟治疗取得了一定成效,但仍面临许多挑战,其中最重要的挑战之一是疟原虫对抗疟药物的抗性增加,因此,寻找降低其死亡率,防止CM发生及减轻CM患者的神经系统后遗症等新的治疗手段尤为重要。但VPA对脑型疟的作用尚不清楚。因此,本课题旨在探讨VPA对CM的神经保护作用。方法1.腹腔注射1×10~4伯氏疟原虫感染的红细胞到C57BL/6小鼠,建立实验性小鼠脑型疟模型,感染6天后,通过心脏取血后离心备用;2.体外培养C57BL/6胎鼠(E13.5天)神经干细胞,3天半量换液,6天后进行传代,培养第三代时,将其种植于多聚赖氨酸包被的24孔板中,3天后,加脑型疟小鼠血清和正常小鼠血清处理神经干细胞,同时加入1mM VPA,分化培基培养5天后,β-Ⅲ-tubulin与GFAP细胞免疫荧光染色、实时荧光定量PCR(β-Ⅲ-tubulin、GFAP)观察神经干细胞向神经元和星形胶质细胞分化的影响;3.体外原代培养C57BL/6小鼠海马神经元,3天半量换液,7天后加脑型疟小鼠血清和正常小鼠血清处理神经元,同时加入1mM VPA,培养3天后,光镜拍照,DCFH-DA检测活性氧水平,CytoTox96?非放射性细胞毒性检测试剂盒检测乳酸脱氢酶(Lactic Dehydrogenase,LDH)释放量,Tunel细胞凋亡检测试剂盒检测凋亡细胞,观察VPA对加有脑型疟小鼠血清的海马神经元的作用;4.腹腔注射1×10~4伯氏疟原虫感染的红细胞到C57BL/6小鼠,建立实验室小鼠脑型疟模型,感染第2天起腹腔注射VPA 300mg/kg,连续注射5天;计算生存率、快速鼠昏迷和行为量表(Rapid Murine Coma and Behavior Scale,RMCBS)进行评分;苏木素-伊红染色观察感染红细胞滞留及出血情况;取脑组织进行伊文斯蓝染色,比较血脑屏障的破坏程度;取脑组织提取RNA,比较IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α的水平;5.腹腔注射1×10~4伯氏疟原虫感染的红细胞到C57BL/6小鼠,建立实验室小鼠脑型疟模型,感染第2天起腹腔注射VPA 300mg/kg,连续注射5天;取脑组织提取RNA,比较脑源性神经营养因子(Brain Derived Neurotrophic Factor,BDNF)、神经胶质细胞源性的神经营养因子(Glial cell line-DerivedNeurotrophic Factor,GDNF)、神经生长因子(Nerve Growth Factor,NGF)等水平,并立即取脑组织进行膜片钳实验,观察VPA对海马区神经元膜电位的影响。结果1.成功体外提取培养胎鼠神经干细胞,细胞免疫荧光染色结果显示加脑型疟小鼠血清后β-Ⅲ-tubulin阳性比例降低,同时加入VPA后β-Ⅲ-tubulin阳性比例升高;加脑型疟小鼠血清后GFAP阳性比例升高,同时加入VPA后GFAP阳性比例降低。荧光实时定量PCR与免疫荧光染色抑制,显示加脑型疟小鼠血清后β-Ⅲ-tubulin含量降低,同时加入VPA后β-Ⅲ-tubulin含量升高;加脑型疟小鼠血清后GFAP含量升高,同时加入VPA后GFAP含量降低;2.成功体外培养海马神经元,结合光镜结果、活性氧含量、LDH释放率及Tunel染色结果可观察到:加入脑型疟小鼠血清后,光镜下海马神经元漂浮细胞增加,活性氧含量增加,LDH释放增加,Tunel凋亡细胞增加,而同时加入VPA后,海马神经元漂浮细胞降低,活性氧含量减少,LDH释放减少,Tunel凋亡细胞减少;3.成功建立实验性脑型疟模型,腹腔注射VPA后小鼠生存时间延长,快速鼠昏迷和行为学评分降低,同时HE染色显示VPA治疗后感染红细胞滞留及出血减少;伊文斯蓝染色结果显示VPA治疗后小鼠血脑屏障破坏减轻;脑组织中IFN-γ、IL-1β、IL-6、TNF-α量均下调,IL-10量上调;4.成功建立实验性脑型疟模型,腹腔注射VPA后,脑组织中BDNF、GDNF量上调,NGF量无变化,膜片钳实验结果显示VPA处理后小鼠海马神经元突触后膜电位得到提高。结论1.通过免疫荧光染色及荧光实时定量可观察到:脑型疟小鼠血清抑制胎鼠来源神经干细胞向神经元方向分化,而VPA能在一定程度上挽救其抑制作用,使神经干细胞向神经元方向分化的比例升高;脑型疟小鼠血清促进其向星形胶质细胞分化,而VPA能在一定程度上使神经干细胞向星形胶质细胞分化的比例降低;2.脑型疟小鼠血清引起胎鼠来源神经元凋亡,而VPA能在一定程度上保护脑型疟小鼠血清引起的神经元凋亡;3.VPA腹腔注射能提高实验性脑型疟小鼠生存率,改善神经系统症状,减轻脑部炎症及感染红细胞滞留的情况,并减轻血脑屏障的破坏;4.VPA腹腔注射能提高实验性脑型疟能提高小鼠海马神经元突触后膜电位,对脑型疟小鼠发挥一定的神经保护作用。
【学位单位】:天津医科大学
【学位级别】:博士
【学位年份】:2019
【中图分类】:R531.3
【部分图文】: 图1分离孕13.5天胎鼠大脑组织过程
神经干细胞的鉴定
海马神经元的鉴定
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