基于茎环引物探针法定量检测乙型肝炎病毒miR-3的方法学建立

发布时间：2021-04-02 03:37

　　目的:本研究拟通过广泛筛选特异性引物探针组,建立一套乙型肝炎病毒（HBV）微小RNA-3（miR-3）的绝对定量PCR检测方法。方法:基于茎环引物RT-qPCR方法原理,设计茎环引物进行逆转录,结合SYBR Green法qPCR进行特异性初筛,选择特异性较佳的引物组,再结合TaqMan MBG探针,确定最佳的引物探针组,实现对HBV miR-3的定量检测。结果:共设计和测试了25套茎环引物组,利用基于SYBR Green的RT-qPCR方法,筛选出6套具有良好特异性的引物组,并进一步针对这些引物组设计和测试了相应的探针,获得了可精准定量HBV miR-3的引物探针组。测试结果表明,该引物探针组不但保证了高特异性,而且定量线性范围达到每个反应102～108拷贝,其扩增效率约为88%。结论:本研究确立了一套可用于绝对定量检测HBV miR-3的特异性引物探针组。 

【文章来源】：中国病理生理杂志. 2020,36(09)北大核心CSCD

【文章页数】：8 页

【部分图文】：

HBV mi R-3特异性引物SYBR Green法筛选

HBV mi R-3特异性高灵敏引物探针组中的筛选

本研究对HBV阳性的Hep3B细胞和HBV阴性的Hep G2细胞提取的mi RNA进行检测，结果如图4所示，C5和C7两套引物Hep3B细胞中HBV mi R-3的Ct值接近40，可认为未检出。C18、KEY、T3和T5均能检测出Hep3B细胞中的HBV mi R-3,Ct值最低为27（在T3中），最高为31（在C18中），且阴性对照RT-free均无扩增。在阳性对照能被顺利检测出的几套引物中，对于Hep G2细胞样品，在C18中未检出，在其余几套中有非特异检出，其中KEY引物探针组在Hep G2细胞中的Ct值约为37，在Hep3B细胞中的Ct值约为29，仍然表现出良好的特异性和敏感性。讨论


本文编号：3114509