慢病毒介导稳定表达HBcAg的P815/c细胞株的建立及鉴定

发布时间：2022-07-20 16:54

　　研究旨在建立稳定表达HBcAg的P815/c細胞株,为评价针对HBcAg的乙肝疫苗的免疫效果提供体外感染的细胞模型。通过构建携带HBcAg基因的慢病毒表达载体质粒pLenti-Ubc-HBcAg-EGFP-3FLAG4RES-Puro,载体质粒携帯有加强型绿色荧光蛋白（eGFP）及嘌呤霉素（Puromycin）抗性标记基因,与包装质粒pLP1、pLP2以及包膜质粒pLP/VSVG共转染人胚肾293T细胞进行包装,得到携帯有HBcAg基因的重组慢病毒颗粒LV-HBcAg-Puro。经纯化、鉴定后转染小鼠肥大瘤细胞株P815细胞72h后,通过加入并维持2μg/mL的嘌呤霉素杀死未被有效感染的细胞,药物筛选约10 d后,免疫荧光及流式细胞仪检测表达GFP的细胞比例在98%以上,Western Blot可检测到转染后细胞内HBcAg的蛋白表达。成功构建稳定表达HBcAg基因的细胞株P815/C,为研究小鼠体内针对HBcAg的疫苗诱发的CTL反应提供了细胞杀伤实验的靶细胞。 

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【文章目录】：
1 材料和方法
    1.1 材料
        1.1.1 细胞、菌株与质粒
        1.1.2 主要仪器及试剂
    1.2 方法
        1.2.1 引物设计
        1.2.2 HBc Ag基因片段的扩增
        1.2.3 携带HBc Ag基因的p Lenti-Ubc-HBc Ag-EG-FP-3FLAG-IRES-Puro表达载体质粒的构建
        1.2.4 重组慢病毒LV-HBc Ag-Puro的包装
        1.2.5 慢病毒滴度测定
        1.2.6 重组慢病毒LV-HBc Ag-Puro转染P815细胞及P815/c稳定株筛选
2 结果
    2.1 HBc Ag目的基因的扩增结果
    2.2 重组克隆的菌落PCR鉴定结果
    2.3 重组慢病毒LV-HBc Ag-Puro的滴度测定
    2.4 重组慢病毒LV-HBc Ag-Puro转染P815细胞的GFP表达检测
    2.5 Western blot检测稳定转染P815细胞的HB-c Ag蛋白表达
3 讨论


【参考文献】：
期刊论文
[1]强制泛素化乙肝病毒核心抗原融合基因表达质粒的构建[J]. 沈楠,余永胜,奚敏,潘庆春,陈小华,臧国庆,汤正好.  中国现代医学杂志. 2010(05)



本文编号：3664375