六种结核分枝杆菌特异性抗原的原核表达及16 KD-38 KD和Ag85A血清学诊断效果的研究

发布时间：2017-05-20 03:14

  本文关键词：六种结核分枝杆菌特异性抗原的原核表达及16 KD-38 KD和Ag85A血清学诊断效果的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：根据GenBank中公布的结核分枝杆菌H37Rv菌株的基因序列设计相应的引物,以H37Rv菌株的总DNA为模板,分别扩增获得fbpA(Ag85A)、fbpB(Ag85B)、 mpt64 (MPT64)、ppe57 (Rv3425)、esxB(CFP10)、hspX (16 KD) 和 pstS1 (38 KD)等七个目的基因。将纯化后的fbpA、fbpB、mpt64、ppe57 和 esxB基因片段同pMD18-T载体连接,测序正确后,克隆入pET30a表达载体,经PCR扩增和双酶切鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)构建原核表达重组菌。IPTG诱导表达BL21 (DE3)重组菌后,SDA-PAGE鉴定重组蛋白的表达,结果显示：Ag85B和CFP10为可溶性蛋白;Ag85A、MPT64和Rv3425主要为包涵体。以纯化后的hspX和pstS1基因片段为模板,利用over-lap PCR扩增获得hspX-pstS1融合基因,克隆入pMD18-T载体,测序正确后,同pET30a表达载体连接,经PCR和双酶切鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),构建原核表达重组菌。IPTG诱导表达BL21 (DE3)重组菌后,SDS-PAGE电泳结果显示16KD-38KD融合蛋白主要以包涵体的形式进行表达。超声破菌后,利用镍离子亲和层析柱纯化带有His标签的重组蛋白。将纯化后的以包涵体形式进行表达的重组蛋白置于透析袋内,用4M尿素、2M尿素和PBS溶液梯度洗脱复性蛋白。分别以复性后的Ag85A 和 16KD-38 KD重组蛋白做为血清学检测抗原包被酶标板,利用间接ELISA法对427份结核阳性血清和356份结核阴性血清进行检测,实验结果显示：抗原Ag85A共测出72份结核阳性血清,188份结核阴性血清,其敏感性为16.86%,特异性为52.81%,准确性为33.21%；抗原16 KD-38KD共测出394份结核阳性血清,315份结核阴性血清,其敏感性为92.27%,特异性为88.48%,准确性为90.55%。本研究成功构建了MTB六种特异性抗原的原核表达重组质粒,其开放阅读框正确、无突变,重组蛋白可以进行大量表达。ELISA实验结果显示16 KD-38 KD具有较高的特异性和敏感性,可以作为结核病抗体检测的候选抗原。
【关键词】：结核病 原核表达 Ag85A 16 KD-38 KD 血清学诊断
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R52
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 缩略词表8-9
• 第一部分 文献综述9-23
• 第一章 结核病的简介9-12
• 1.1 结核病现状9
• 1.2 结核分枝杆菌9-10
• 1.3 结核分枝杆菌的感染机制10-11
• 1.4 机体的免疫应答机制11-12
• 第二章 结核病的实验室诊断方法12-17
• 2.1 细菌学诊断12-13
• 2.1.1 痰涂片镜检12
• 2.1.2 痰样本培养12-13
• 2.2 血清学诊断13-14
• 2.3 结核菌素皮肤实验14
• 2.4 IFN-γ释放试验14-15
• 2.5 DNA水平的诊断15-16
• 2.6 生物传感器诊断16-17
• 第三章 六种结核分枝杆菌特异性抗原的研究进展17-23
• 3.1 MPT6418
• 3.2 16KD18-19
• 3.3 38KD19-20
• 3.4 CFP1020-21
• 3.5 Rv342521
• 3.6 Ag85复合物21-23
• 第二部分 研究内容23-62
• 第一章 六种MTB特异性抗原的原核表达及纯化23-53
• 1.1 材料23-27
• 1.2 方法27-34
• 1.2.1 原核表达重组菌的构建27-32
• 1.2.1.1 目的基因的扩增27-29
• 1.2.1.2 PCR产物的胶回收29
• 1.2.1.3 pMD18-T和目的基因重组载体的构建29
• 1.2.1.4 转化E.coli DH5α感受态细胞29
• 1.2.1.5 转化产物的鉴定29-31
• 1.2.1.6 pMD18-T重组质粒和pET-30a空载体的双酶切31
• 1.2.1.7 目的基因和pET-30a空载体的连接31
• 1.2.1.8 连接产物的转化31-32
• 1.2.1.9 重组菌的鉴定32
• 1.2.2 重组菌的诱导表达、表达条件的优化及表达产物的鉴定32-33
• 1.2.2.1 重组菌的诱导表达和表达条件的优化32
• 1.2.2.2 重组蛋白的SDS-PAGE鉴定32-33
• 1.2.2.3 表达产物的定性分析33
• 1.2.3 重组蛋白的纯化和复性33-34
• 1.2.3.1 重组蛋白的纯化33-34
• 1.2.3.2 重组蛋白的复性34
• 1.3 结果34-48
• 1.3.1 抗原MPT64原核表达实验结果34-37
• 1.3.2 抗原16KD-38KD融合蛋白原核表达实验结果37-40
• 1.3.3 抗原CFP10原核表达实验结果40-42
• 1.3.4 抗原Rv3425原核表达实验结果42-44
• 1.3.5 抗原Ag85A原核表达实验结果44-46
• 1.3.6 抗原Ag85B原核表达实验结果46-48
• 1.4 讨论48-52
• 1.5 小结52-53
• 第二章 Ag85A和16KD-38KD血清学诊断效果的研究53-62
• 2.1 材料53-54
• 2.1.1 主要试剂53
• 2.1.2 主要仪器53
• 2.1.3 ELISA反应相关溶液的制备53-54
• 2.2 方法54-55
• 2.2.1 棋盘滴定法确定最适的抗原包被浓度和酶标二抗的工作浓度54-55
• 2.2.1.1 包被54
• 2.2.1.2 封闭54
• 2.2.1.3 加待检血清54-55
• 2.2.1.4 加HRP标记的羊抗人IgG55
• 2.2.1.5 显色55
• 2.2.1.6 终止55
• 2.2.2 间接ELISA法评价重组蛋白的血清学诊断效果55
• 2.2.3 统计学分析ELISA检测结果55
• 2.3 实验结果55-58
• 2.3.1 棋盘滴定法确定的最适抗原包被浓度和酶标二抗的工作浓度55-58
• 2.3.2 Ag85A和16KD-38KD的血清学检测结果58
• 2.4 讨论58-61
• 2.5 小结61-62
• 参考文献62-69
• 致谢69

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 吴静希;岳俊杰;姜永强;郝淮杰;李艳;;结核分枝杆菌Rv3425特异性蛋白片段与CFP10-ESAT6融合蛋白在结核抗体检测中的应用价值[J];生物技术通讯;2011年03期

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 李红霞;结核分枝杆菌特异性抗原/抗体ELISA检测试剂盒的初步研究[D];四川大学;2007年

  本文关键词：六种结核分枝杆菌特异性抗原的原核表达及16 KD-38 KD和Ag85A血清学诊断效果的研究，由笔耕文化传播整理发布。

，

本文编号：380562