基因重组弓形虫GRA7诊断弓形虫病的研究

发布时间：2024-04-15 02:04

　　目的:克隆、表达并纯化弓形虫重组蛋白GRA7,分析其检测弓形虫感染的能力,为弓形虫病诊断提供新的实验依据。方法:(1)根据GenBank中弓形虫GRA7基因序列设计并合成引物,以弓形虫RH株基因组DNA为模版,利用聚合酶链反应(PCR)扩增GRA7基因片段,将目的基因克隆至pMD-18T载体,经过菌落PCR、双酶切和测序鉴定阳性菌落。(2)将序列正确的GRA7基因亚克隆至表达载体pET-28a(+),构建重组质粒pET-28a-GRA7。将pET-28a-GRA7转化E.coliBL21,筛选出阳性菌株并加以扩增,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白GRA7,采用超声裂解法裂解菌体,His-bindrM柱层析(Ni2+-NTA)纯化重组蛋白,Western-blot分析重组蛋白的反应原性,ELISA检测弓形虫感染者血清中的IgG和IgM,评价其诊断弓形虫感染的价值。结果:(1)克隆获得约630bp的GRA7基因,成功构建了原核重组表达质粒pET-28a-GRA7;(2)经表达和纯化后获得分子量约33kDa的GRA7重组蛋白,Western-blot显示该重组蛋白能与...

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图１．ＧＲＡ７基因的扩增Ｍ：?ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；?１：?ＧＲＡ７；?２：阴性对照；??

Ｍ：?ＤＮＡｍａｒｋｅｒ；?１：?ＧＲＡ７鉴定：??及双酶切鉴定图谱分别见０ｂｐ的片段，与目的基因大６００ｂｐ的基因片段；重组质得ＧＲＡ７基因与发表在Ｇ同源性达９９％，第１８９位为同义突变。说明ＧＲＡ７

图２．ｐＭＤ－ＧＲＡ７的菌落ＰＣＲ?

图２．ｐＭＤ－ＧＲＡ７的菌落ＰＣＲ?图３．ｐＭＤ－ＧＲＡ７的双酶Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；?Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；??１：?ｐＭＤ－ＧＲＡ７的菌落ＰＣＲ产物；?１：空白对照；??２：阴性对照?２：?ｐＭＤ－ＧＲＡ７的双酶Ｓｃｏｒｅ?ｔｘｐｅｔｖｌ?ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ?Ｇ....

图３．ｐＭＤ－ＧＲＡ７的双酶切鉴定??Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；?Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；??

图２．ｐＭＤ－ＧＲＡ７的菌落ＰＣＲ?图３．ｐＭＤ－ＧＲＡ７的双酶Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；?Ｍ：?ＤＮＡ?ｍａｒｋｅｒ；??１：?ｐＭＤ－ＧＲＡ７的菌落ＰＣＲ产物；?１：空白对照；??２：阴性对照?２：?ｐＭＤ－ＧＲＡ７的双酶Ｓｃｏｒｅ?ｔｘｐｅｔｖｌ?ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ?Ｇ....

图７．ＧＲＡ７表达产物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ??

３：空白对照??３．重组ＧＲＡ７蛋白的诱导表达及纯化??重组ｐＥＴ－２８ａ－ＧＲＡ７诱导表达后产物的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果见图７。由图７可见，??相比于诱导前，诱导后的重组菌在约３３ｋＤａ处的蛋白条带更为明显，与预计重??组蛋白的大小相符；诱导表达后的重组蛋白以可溶性蛋白为主；经金....

本文编号：3955566