毒素—抗毒素系统与结核分枝杆菌持留性的相关研究

发布时间：2017-08-16 05:03

  本文关键词：毒素—抗毒素系统与结核分枝杆菌持留性的相关研究

  更多相关文章： 结核分枝杆菌 mazEF基因 relBE基因 同源重组 持留性

【摘要】：目的:本研究拟通过构建结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统缺失株,初步研究其在不同培养条件下对结核分枝杆菌生存能力的影响,并对毒素-抗毒素系统与结核分枝杆菌持留性相关性进行初步探讨。方法:1.结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统缺失株的构建及鉴定。首先以聚合酶链反应(PCR)分别从H37Rv标准株和PUC-19K质粒上扩增出目的基因的同源臂及卡那霉素抗性基因kan基因;然后应用融合PCR技术将目的基因的同源臂和kan基因进行杂交拼接,获得目的融合片段,将该融合片段克隆于p MD-19T(simple)载体形成自杀质粒p MD-19T-Δmaz EF-kan和自杀质粒p MD-19T-Δrel BE-kan,并将自杀质粒分别转化至大肠杆菌DH5a中;最后利用电穿孔技术将自杀质粒电转至H37Rv感受态细胞中;在卡那霉素抗性改良罗氏培养基上筛选出H37RvΔmaz EF和H37RvΔrel BE缺失突变株单个菌落,提取阳性菌株全基因组DNA为模板,PCR扩增克隆片段并测序,并对所获得H37RvΔmaz EF和H37RvΔrel BE缺失突变株进行遗传稳定性检测。2.结核分枝杆菌H37RvΔMaz EF缺失突变株的生长表型和在不同培养条件下生存能力的初步检测。分别对野生型和缺失株进行抗酸染色,镜下观察菌株形态学的改变;分别在低氧和营养缺乏的培养基中培养缺失株和野生株,并在不同的时间点对菌落进行计数,比较野生株和缺失株在应激条件下,生存能力是否存在差异。3.分别用H37Rv、H37RvΔmaz EF3、H37RvΔmaz EF6和H37RvΔmaz EF9菌株感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过CFU计数初步检测结核分枝杆菌感染巨噬细胞后细菌的生存能力;利用流式细胞仪CELLQest和Win MDl2.9 Version软件检测巨噬细胞感染后的凋亡情况。结果:经传代15代后,再次测序,未发生回复性突变,得到具有遗传稳定性的H37RvΔMaz EF和H37RvΔRel BE基因缺失株。抗酸染色显示,H37RvΔmaz EF菌株较野生菌株其形态短小;同时,CFU计数结果显示缺失菌株生长缓慢。细菌感染巨噬细胞后,缺失株在巨噬细胞内的生存能力低于野生菌株,且H37RvΔmaz EF菌株感染组,巨噬细胞的凋亡率高于H37Rv菌株感染组。结论:maz EF毒素-抗毒素系统有助于结核分枝杆菌在应激环境下的持留生存。研究结果表明了结核分枝杆菌感染机体后的持留性及其潜伏感染是多因素相互作用的结果,确切的感染机制有待于进一步研究。
【关键词】：结核分枝杆菌 mazEF基因 relBE基因 同源重组 持留性
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R52
【目录】：

• 中文摘要5-6
• 英文摘要6-8
• 英文及字符缩略词表8-9
• 前言9-11
• 材料11-15
• 1.1 菌种来源11
• 1.2 主要仪器设备11-12
• 1.3 主要实验试剂12-13
• 1.4 常用试剂的配制方法13-15
• 方法15-25
• 2.1 结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统maz EF和rel BE缺失株的构建及鉴定15-22
• 2.2 结核分枝杆菌H37RvΔMaz EF缺失突变株生存能力的初步检测22-23
• 2.3 毒素-抗毒素系统Maz EF基因与结核分枝杆菌持留性的相关研究23-24
• 2.4 统计学分析24-25
• 结果25-35
• 3.1 结核分枝杆菌H37RvΔMaz EF和H37RvΔRel BE缺失突变株的筛选和鉴定25-30
• 3.2 结核分枝杆菌H37RvΔMaz EF缺失突变株生存能力的初步研究30-31
• 3.3 毒素-抗毒素系统与结核分枝杆菌持留性的相关研究31-35
• 讨论35-41
• 4.1 结核病流行及疫情现状35
• 4.2 结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统35-36
• 4.3 结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统Maz EF36
• 4.4 结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统Rel BE36-37
• 4.5 结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统缺失株的构建37-38
• 4.6 结核分枝杆菌毒素-抗毒素系统缺失株表型及其与生物学功能初步性分析38-41
• 结论41-42
• 参考文献42-47
• 文献综述47-57
• 参考文献51-57
• 致谢57-58
• 作者 简介58-59
• 导师评阅表59

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 姚楠;董江涛;徐芳;田玺泽;吴芳;章乐;吴江东;张万江;;结核分枝杆菌Hsp16.3与感染巨噬细胞凋亡的相关性研究[J];中国病原生物学杂志;2012年08期

2 董江涛;徐芳;田玺择;姚楠;吴芳;章乐;王远志;曹旭东;张万江;;不同毒力结核分枝杆菌感染小鼠对肺泡巨噬细胞的凋亡率及其时相性变化的影响[J];中国免疫学杂志;2012年05期

3 董伟杰;张万江;;结核分枝杆菌对感染宿主细胞凋亡的调控作用研究[J];新医学;2012年02期

4 贤一博;崔丽丹;张俊杰;;结核枝杆菌中毒素-抗毒素系统的鉴定[J];微生物学报;2011年02期

5 石娅莉;鲍朗;商正玲;;结核分枝杆菌RelE毒素蛋白对肺癌A-549细胞成瘤性的抑制作用[J];西部医学;2010年11期

6 ;High activity of Mj HSP16.5 under acidic condition[J];Science in China(Series B:Chemistry);2009年03期

7 乔凤;陈泽良;王玉飞;赵瑾;杜昕颖;于雅琴;黄留玉;;pUC19K质粒的构建及其在布鲁氏菌突变株构建中的应用[J];中国生物工程杂志;2007年12期

8 夏飞,刘胜武,魏雅稚,肖凌;结核分枝杆菌诱导宿主巨噬细胞凋亡机制初探[J];中华微生物学和免疫学杂志;2005年06期

，

本文编号：681517