小鼠Prdx6与布鲁氏菌胞内寄生关系的研究

发布时间：2017-09-08 15:09

  本文关键词：小鼠Prdx6与布鲁氏菌胞内寄生关系的研究

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【摘要】：布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病),是一种流行范围广,对人畜危害大的人兽共患病,我国卫生部将其列为二类传染病。布鲁氏菌(Brucella)作为该病的病原菌,目前已知的易感动物达60多种,其中主要为绵羊,猪和牛等,感染动物可出现流产、不育等症状,人感染布鲁氏菌后主要表现为持续性间歇性发热,关节疼痛等。布鲁氏菌可以在宿主细胞内生存与复制。布鲁氏菌通过皮肤、消化道或呼吸道黏膜进入机体,主要寄生于巨噬细胞内,通过先天和后天免疫逃避机制,在宿主细胞内生存与繁殖,后转移至部分淋巴结中,形成原发性病灶。当布鲁氏菌胞内繁殖达到一定程度后,使巨噬细胞破裂,随血液或淋巴液转移至其他宿主细胞,期间由于内毒素,细菌荚膜刺激引起机体发热。当布鲁氏菌定植到新宿主细胞后,再次进行胞内寄生,如此循环往复寄生-转移-寄生,引发了布鲁氏菌感染后的典型症状“波浪热”。目前,布鲁氏菌在巨噬细胞内的免疫逃避机制尚不完全清楚,因此,研究布鲁氏菌胞内寄生相关蛋白具有重要意义。过氧化物氧还酶6(Peroxiredoxin 6,Prdx6)是非硒依赖性过氧化物酶家族中的一员,Prdx6区别于家族其它成员,主要在于该蛋白是1-Cys酶,以谷胱甘肽作为电子供体。研究表明Prdx6是一种双功能蛋白,既有GSH过氧化物酶活性,又具有磷脂酶A2活性,在帮助机体抵抗氧化损伤、调节细胞凋亡等方面发挥重要作用。前期研究表明,绵羊感染布鲁氏菌后,机体内Prdx6出现明显差异表达,但Prdx6表达与布鲁氏菌之间相互关系尚不明确。为了探讨Prdx6与布鲁氏菌胞内寄生的关系,本研究克隆小鼠Prdx6编码序列,构建原核表达载体,原核表达重组Prdx6蛋白并进行纯化,以纯化的Prdx6蛋白制备兔源多克隆抗体及鼠源单克隆抗体,用于后续检测。通过布鲁氏菌S2弱毒株等细菌感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,分析胞内Prdx6表达变化。通过构建Prdx6过表达载体和sh RNA干扰载体调节巨噬细胞内Prdx6表达水平,检测布鲁氏菌感染与胞内寄生菌量变化,分析胞内Prdx6差异表达对布鲁氏菌感染与寄生的影响。实验结果表明克隆小鼠Prdx6编码序列正确,并成功构建小鼠Prdx6原核表达载体,利用诱导表达及His标签亲和层析纯化技术获得重组小鼠Prdx6蛋白,并验证其具有抗氧化活性。以重组小鼠Prdx6蛋白免疫家兔和BALB/c小鼠,制备小鼠Prdx6兔源多克隆抗体和鼠源单克隆抗体,两种抗体特异性良好。布鲁氏菌S2弱毒株感染巨噬细胞,胞内Prdx6表达水平呈先下降后上升趋势,表明布鲁氏菌感染导致Prdx6差异表达。通过过表达提高巨噬细胞内Prdx6表达水平,可提高布鲁氏菌感染量及胞内生存能力。以sh RNA干扰降低胞内Prdx6表达水平,可降低布鲁氏菌感染量及胞内生存能力。本研究发现机体Prdx6差异表达可影响布鲁氏菌感染与胞内寄生,宿主细胞上调表达Prdx6有利于布鲁氏菌感染及胞内生存。为进一步研究Prdx6影响布鲁氏菌胞内寄生作用机制,及能否以Prdx6为靶标有效的预防和治疗布鲁氏菌病提供科学依据。
【关键词】：过氧化物氧还酶6 布鲁氏菌 胞内寄生 小鼠 巨噬细胞
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R516.7
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 英文缩写词表12-13
• 引言13-14
• 第一篇 文献综述14-27
• 第1章 布鲁氏菌病的研究进展14-22
• 1.1 布鲁氏菌病概述14-15
• 1.2 布鲁氏菌胞内寄生研究进展15-18
• 1.3 布鲁氏菌病检测方法的研究进展18-20
• 1.4 布鲁氏菌病的防控展望20-22
• 第2章 Peroxiredoxin 6 的研究进展22-26
• 2.1 Prdx6结构与功能22-23
• 2.2 Prdx6生物体分布23
• 2.3 Prdx6与相关疾病的研究23-26
• 小结与展望26-27
• 第二篇 研究内容27-81
• 第1章 小鼠Prdx6编码区DNA克隆、表达及活性分析27-44
• 1.1 材料27-32
• 1.2 方法32-38
• 1.3 结果38-42
• 1.4 讨论42-44
• 第2章 小鼠Prdx6多抗及单克隆抗体的制备44-58
• 2.1 材料44-45
• 2.2 方法45-53
• 2.3 结果53-56
• 2.4 讨论56-57
• 2.5 小结57-58
• 第3章 布鲁氏菌感染小鼠巨噬细胞Prdx6差异表达分析58-68
• 3.1 材料58-59
• 3.2 方法59-62
• 3.3 结果62-66
• 3.4 讨论66-67
• 3.5 小结67-68
• 第4章 Prdx6差异表达对布鲁氏菌胞内寄生的影响68-81
• 4.1 材料68-69
• 4.2 方法69-71
• 4.3 结果71-79
• 4.4 讨论79-80
• 4.5 小结80-81
• 结论81-82
• 参考文献82-90
• 导师简介90-91
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果91-92
• 致谢92

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本文编号：814711