黄芩苷联合连翘苷对甲型流感病毒核蛋白基因表达影响的体外实验研究

发布时间：2017-09-13 12:33

  本文关键词：黄芩苷联合连翘苷对甲型流感病毒核蛋白基因表达影响的体外实验研究

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【摘要】：目的:初步探讨黄芩苷联合连翘苷对甲型流感病毒核蛋白基因(NP基因)表达的影响,为寻找高效的抗流感病毒中药复方提供理论和实验依据。方法:1.采用细胞病变法(CPE)测试药物(黄芩苷、连翘苷)对Hela细胞的最大无毒浓度,确定各种药物的实验浓度;2.甲型流感病毒NP真核表达载体pc DNA3.1(+)/NP运用脂质体法转染Hela细胞,作为实验用靶细胞,反转录-实时荧光定量PCR(RT-q PCR)确定成功转染Hela细胞;3.反转录-实时荧光定量PCR(RT-q PCR)评价黄芩苷联合连翘苷对靶细胞NP基因表达的影响,运用统计学相关软件进行分析;4.反转录-实时荧光定量PCR(RT-q PCR)评价不同浓度黄芩苷、连翘苷对靶细胞NP基因表达的抑制作用,并计算黄芩苷、连翘苷对靶细胞的半数抑制浓度(IC50);5.反转录-实时荧光定量PCR(RT-q PCR)评价IC25、IC50剂量的黄芩苷联合IC25、IC50、IC75剂量的连翘苷对靶细胞NP基因表达的联合作用效果(协同、相加、拮抗)。本实验设Hela细胞组、脂质体组、重组质粒转染组(转染pc DNA3.1(+)/NP)、黄芩苷组、连翘苷组、黄芩苷联合连翘苷组。结果:1.细胞病变法得出各种药物的最大无毒浓度分别为:黄芩苷:31.25μg·ml-1,连翘苷:25μg·ml-1;实验浓度:黄芩苷:15.625μg·ml-1,连翘苷:12.5μg·ml-1;且黄芩苷(15.625μg·ml-1)联合连翘苷(12.5μg·ml-1)显示无毒。2.重组质粒转染组NP基因表达量明显高于Hela细胞组,差异具有显著统计学意义(t=7.742,P0.01);重组质粒转染组NP基因表达量明显高于脂质体组,差异具有显著统计学意义(t=7.802,P0.01);说明流感病毒真核表达载体pc DNA3.1(+)/NP成功转染Hela细胞。3.黄芩苷(15.625μg·ml-1)联合连翘苷(12.5μg·ml-1)组NP基因表达量明显低于重组质粒转染组,差异具有显著统计学意义(t=6.966,P0.01)。4.在一定浓度范围内,黄芩苷、连翘苷对靶细胞NP基因表达有明显的抑制作用,且抑制作用呈浓度依赖性;黄芩苷、连翘苷对靶细胞NP基因表达的IC50分别为:10.4627μg·ml-1,4.16832μg·ml-1。5.低浓度、中浓度黄芩苷(IC25、IC50)联合低浓度、中浓度、高连翘苷(IC25、IC50、IC75)对靶细胞NP基因表达的抑制作用CI值分别为:IC25黄芩苷+IC25连翘苷:1.24169;IC25黄芩苷+IC50连翘苷:0.95414;IC25黄芩苷+IC75连翘苷:0.94745;IC50黄芩苷+IC25连翘苷:0.89460;IC50黄芩苷+IC50连翘苷:0.85482;IC50黄芩苷+IC75连翘苷:0.89201。低浓度黄芩苷联合低浓度连翘苷起拮抗作用CI1;余浓度联合起协同作用CI1。结论:黄芩苷联合连翘苷能够下调转染Hela细胞的甲型流感病毒NP基因表达量,并且在一定浓度范围内显示出协同作用。
【关键词】：黄芩苷 连翘苷 联合作用 中药 甲型流感病毒 核蛋白(NP)
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R511.7
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 中英文缩略词表9-10
• 第1章 引言10-17
• 1.1 流行病学10
• 1.2 甲型流感病毒10-11
• 1.3 流感的预防和治疗进展11-13
• 1.3.1 流感疫苗研究进展11-12
• 1.3.2 抗流感药物研究进展12-13
• 1.4 甲型流感病毒核蛋白13
• 1.5 基于核蛋白（NP）为靶点的抗病毒研究13-15
• 1.5.1 抗流感病毒核蛋白机制14
• 1.5.2 流感病毒核蛋白抑制剂14-15
• 1.6 中药抗流感病毒研究状况15-17
• 第2章 材料与方法17-29
• 2.1 实验材料17-19
• 2.1.1 实验对象17
• 2.1.2 实验仪器17-18
• 2.1.3 实验试剂18
• 2.1.4 实验药物18-19
• 2.1.5 PCR引物19
• 2.2 实验方法19-29
• 2.2.1 细胞培养19-21
• 2.2.2 细胞病变法确定药物的实验浓度21
• 2.2.3 甲型流感病毒NP真核表达载体pcDNA3.1(+)/NP质粒提取21-22
• 2.2.4 pcDNA3.1(+)/NP质粒浓度和纯度的测定22-23
• 2.2.5 脂质体法pcDNA3.1(+)／NP质粒转染及药物干预23-24
• 2.2.6 TRIzol法总RNA提取与测定24
• 2.2.7 反转录PCR24-25
• 2.2.8 qPCR法制备标准曲线及NP基因起始表达量的测定25-27
• 2.2.9 数据处理27-29
• 第3章 实验结果29-36
• 3.1 药物实验浓度结果29-30
• 3.2 甲型流感病毒NP真核表达载体PCDNA3.1(+)/NP标准曲线30-31
• 3.3 QPCR法测量NP基因的表达31-33
• 3.3.1 流感病毒真核表达载体pc DNA3.1(+)/NP转染Hela细胞的检测31-32
• 3.3.2 黄芩苷联合连翘苷组细胞内NP基因表达量32-33
• 3.4 不同浓度黄芩苷、连翘苷对靶细胞NP基因表达的抑制作用33-34
• 3.5 不同浓度黄芩苷联合连翘苷对靶细胞NP基因表达的抑制作用及各组CI值34-36
• 第4章 讨论36-40
• 第5章 结论与展望40-41
• 5.1 结论40
• 5.2 展望40-41
• 致谢41-42
• 参考文献42-48
• 攻读学位期间的研究成果48-49
• 综述49-59
• 参考文献57-59

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 刘燕;王林林;姚华;史玉柱;司丽君;张莉;黄华;;滨蒿总黄酮对流感病毒PR8株感染小鼠的保护作用[J];中药药理与临床;2016年01期

2 吴婷;魏珊;李敏;张淑蓉;;山西道地连翘体外抗甲型流感病毒活性的研究[J];时珍国医国药;2016年01期

3 刘畅;钱彦方;胡京红;朱宇婷;魏震;张秀霞;赵珈艺;孙红梅;;益气养阴除结方联合顺铂对肺腺癌A549细胞生长及凋亡的影响[J];北京中医药大学学报;2015年12期

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5 张照研;张会敏;周U，

本文编号：843765