白念珠菌ADH1缺失株对氟康唑的MIC及其外排泵相关机制的初步研究

发布时间：2017-09-16 13:41

  本文关键词：白念珠菌ADH1缺失株对氟康唑的MIC及其外排泵相关机制的初步研究

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【摘要】：目的:探讨白念珠菌(Candida albicans)ADH1(alcohol dehydrogenase I)基因缺失后对氟康唑(fluconazole,FLC)的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)的影响,并进而探讨其变化是否与外排泵机制相关。方法:以白念珠菌SC5314株、以其为亲本构建的白念珠菌ADH1基因缺失株EX2与回复株RE1为研究对象,按照美国临床与实验室标准协会(Clinical and laboratory standards institute,CLSI)M27-A3方案的微量稀释法测定FLC作用对这三株白念珠菌酵母相的MIC水平,以考察ADH1基因缺失后菌细胞对FLC的体外敏感性变化;并同时通过琼脂点板实验(spot assay)测定菌细胞对FLC的药物敏感性变化,以比较其在固体培养基上的结果与上述MIC值是否一致。通过罗丹明123的蓄积/外排实验测定FLC存在时三株菌株外排泵功能差异;并通过RT-PCR技术测定FLC作用对菌株外排泵相关基因(CDR1、CDR2、MDR1)在m RNA水平的表达情况差异,以考察ADH1基因缺失对白念珠菌外排泵功能及主要外排泵耐药基因表达的影响。通过检测线粒体膜电位、细胞内ATP水平初步考察ADH1基因敲除后对FLC敏感性的影响是否与能量代谢相关。结果:1.微量稀释法结果显示,白念珠菌ADH1缺失株EX2对FLC的MIC较亲本株SC5314及回复株RE1均降低,其中72小时后MIC50、MIC80均下降两个梯度,48小时后MIC50、MIC80均下降一个梯度;亲本株SC5314与回复株RE1之间对FLC的MIC50、MIC80在48小时、72小时均无差异。琼脂点板实验结果亦显示,ADH1缺失株EX2对FLC的敏感性较亲本株SC5314、回复株RE1升高,亲本株SC5314与回复株RE1之间对FLC的敏感性无明显差异。2.蓄积实验后,缺失株EX2细胞内罗丹明123阳性细胞百分比分别为亲本株SC5314及回复株RE1的2.09倍及1.67倍(P0.05),EX2对罗丹明123的蓄积增加;外排实验后,缺失株EX2细胞内的罗丹明123阳性细胞百分比分别为亲本株SC5314及回复株RE1的2.27倍及2.13倍(P0.05),EX2对罗丹明123的外排减少。亲本株SC5314及回复株RE1之间对罗丹明123的蓄积与外排均无明显差异(P0.05)。3.RT-PCR结果表明,ADH1缺失株EX2 MDR1基因在m RNA水平的表达分别为亲本株SC5314及回复株RE1的0.32倍、0.29倍(P0.05),CDR2基因在m RNA水平的表达分别为亲本株SC5314及回复株RE1的3.10倍、2.12倍(P0.05),CDR1基因在m RNA水平的表达分别为亲本株SC5314及回复株RE1的1.42倍及1.18倍(P0.05)。缺失株EX2中外排泵基因CDR2表达上升,MDR1表达下降,CDR1基因表达无明显差异。亲本株SC5314与回复株RE1之间外排泵基因CDR1、CDR2、MDR1在m RNA水平的表达均无明显差异(P0.05)。4.ADH1缺失株EX2、亲本株SC5314、回复株RE1的线粒体膜电位荧光比值分别为7.93、12.84、11.47,其中缺失株EX2较亲本株SC5314及回复株RE1线粒体膜电位均降低(P0.05),亲本株SC5314与回复株RE1线粒体膜电位无明显差异(P0.05)。5.ADH1缺失株EX2、亲本株SC5314、回复株RE1细胞内ATP水平分别为374.51n M、568.82 n M、517.94 n M,缺失株EX2细胞内ATP水平较亲本株SC5314和回复株RE1均降低(P0.05),亲本株SC5314与回复株RE1的细胞内ATP水平无明显差异(P0.05)。结论:ADH1基因可能是参与白念珠菌对氟康唑耐药的基因,其机制可能与通过影响细胞内ATP水平及线粒体膜电位,进而上调外排泵基因MDR1表达,影响外排泵功能有关。
【关键词】：白念珠菌 ADH1基因 MIC 耐药性 外排泵
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R519.3
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 前言8-14
• 1 白念珠菌的感染耐药及治疗现状9-10
• 2 白念珠菌对唑类药物的耐药机制10-11
• 3 ADH1基因及其耐药性相关研究现状11-13
• 4 本实验的研究思路方法，，意义以及创新性13-14
• 第一部分 白念珠菌ADH1缺失株对氟康唑的敏感性研究14-22
• 前言14-15
• 1 材料与方法15-18
• 2 实验结果18-20
• 3 讨论20
• 4 小结20-22
• 第二部分 白念珠菌ADH1基因缺失后对外排泵及能量代谢的影响22-37
• 前言22
• 1 材料与方法22-28
• 2 实验结果28-33
• 3 讨论33-36
• 4 小结36-37
• 全文讨论37-38
• 结论38-39
• 缩略词表39-40
• 参考文献40-44
• 附录44-45
• 致谢45

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本文编号：863418