三种猪小DNA病毒在猪不同组织中的检测研究

发布时间：2017-10-10 09:40

  本文关键词：三种猪小DNA病毒在猪不同组织中的检测研究

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【摘要】：近年来,随着分子生物学技术在病毒学研究中的广泛应用,多种新的病原在猪群中被发现,尤其是小DNA病毒直接或间接地给养猪业带来了巨大的危害。猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)、猪细环病毒(Porcine torque sus tenovirus,TTSuV)以及猪博卡病毒(Porcine bocavirus,PBoV)都属于小DNA病毒,其基因组序列全长均在1.7kb-5.9kb之间。目前对于TTSuV和PBoV的直接致病性和复制机理尚不清楚。许多研究表明,在患有PMWS的病猪中,TTSuV和PBoV的检出率明显高于正常猪群,可能这三种小DNA病毒之间存在着某种协同作用。本研究分别对疑似PCV2感染病猪的不同组织脏器进行PCV2、TTSuV和PBoV的PCR检测,以期为后续研究这三种小DNA病毒在引发疾病方面是否存在协同作用奠定基础,同时也为研究TTSuV和PBoV的发病机制提供一定的依据。本研究对江西省11个县市采集到的疑似猪圆环病毒2型感染的不同阶段同一病猪的肺脏、脾脏、小肠、腹股沟淋巴结和血液样品169份分别进行PCV2、TTSuV和PBoV的PCR检测,检测结果显示,PCV2、TTSuV和PBoV在江西地区猪群普遍感染,且不同地区的感染率不一。PCV2阳性病料数为165份,阳性率为97.63%;PBo V阳性病料数为77份,阳性率为45.56%;TTSuV阳性病料数为85份,阳性率为50.3%,其中TTSuV1的阳性率为21.3%(36/169),TTSuV2的阳性率为40.83%(69/169),TTSuV1和TTSuV2的共感染率为11.83%(20/169)。PCV2和PBoV共感染样品数为77份,感染率为45.56%,PCV2和TTSuV共感染样品数为83份,感染率为49.11%,PBoV和TTSuV共感染样品数与PCV2、PBoV和TTSuV三者共同感染样品数均为43份,感染率为25.44%。为了解三种小DNA病毒在不同生长阶段的感染情况,本研究对169头各生长阶段猪的组织样品进行三种小DNA病毒的检测,结果显示,PCV2在不同生长阶段的检出率均在95%以上,其中育肥猪检出率达到了100%;PBoV在保育猪中的检出率最高,其次是哺乳猪和育肥猪;TTSuV在育肥猪的检出率最高,检测率会随着日龄的增长而升高。为了解三种小DNA病毒在不同组织器官中的感染情况,本研究对169头猪的不同组织器官分别进行三种小DNA病毒的检测,结果显示,在165份PCV2阳性样品中,腹股沟淋巴结中的阳性样品数最多,为146份,阳性率达到了88.48%,阳性率最低的为小肠(112/165,67.88%);在77份PBoV阳性样品中,阳性率最高的为脾脏(46/77,59.74%)和小肠(44/77,57.14%)最低的为血液(36/77,46.75%);不同组织器官中TTSuV、TTSuV1、TTSuV2以及TTSuV1和TTSuV2共感染的检出率呈现出相同的趋势,血液中的检出率显著高于其他组织器官。参考GenBank公布的序列设计一对PBoV NP1基因扩增引物,通过T-A克隆、序列测定与拼接获得了3株PBoV NP1基因序列,长度均为657 bp。系统进化树表明,试验获得的三株猪博卡病毒NP1基因在同一分支上,与中国湖北SX株(HQ223038)和上海H18株(HQ291308)亲缘关系近,与引入的人博卡病毒、猩猩博卡病毒、犬细小病毒、牛细小病毒以及猪细小病毒属于不同的分支,亲缘关系较远。所引入的猪博卡病毒毒株形成三个分支,不同分支之间的亲缘关系较远。试验获得的三株猪博卡病毒NP1基因选取一株PBoV NP1基因序列JA/JX/NP1进行蛋白分析发现,JA/JX/NP1编码蛋白含219个氨基酸,该蛋白抗原性较好,抗原位点主要位点1-94、100-114、119-166、195-207处。JA/JX/NP1编码蛋白亲水性较好,大部分区域为亲水性,亲水性较大的区域主要是:1-93、99-156、159-170、172-205等。
【关键词】：PCV2 PBoV TTSuV NP1 序列分析
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 缩略词表10-11
• 第一章 猪圆环病毒11-20
• 1 PCV的发现11
• 2 PCV的分类11
• 3 PCV的病原特征11-12
• 4 PCV的基因组结构12
• 5 PCV的致病机理12
• 6 PCV的流行病学12-14
• 7 猪圆环病毒感染相关疾病14-16
• 7.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）14-15
• 7.2 猪皮炎肾病综合征（PNDS）15
• 7.3 母猪繁殖障碍15
• 7.4 猪呼吸道综合征（PRDC）15
• 7.5 增生性坏死性肺炎（PNP）15-16
• 7.6 仔猪先天性震颤（CT）16
• 7.7 肠炎16
• 8 PCV2感染诊断相关方法16-19
• 8.1 血清学诊断方法16-17
• 8.2 病原学诊断方法17-19
• 9 猪圆环病毒感染相关疾病的防控19-20
• 第二章 猪细环病毒20-23
• 1 发现史20
• 2 分类20
• 3 病原学20-21
• 3.1 理化特性20
• 3.2 病毒培养20
• 3.3 基因组结构20-21
• 3.4 致病性21
• 4 流行病学21-22
• 5 诊断方法22-23
• 5.1 病原学诊断22
• 5.2 血清学诊断方法22-23
• 第三章 猪博卡病毒23-27
• 1 概述23
• 2 分类23
• 3 病原学23-24
• 4 致病性24
• 5 流行病学24-25
• 6 诊断技术25-27
• 6.1 PCR25
• 6.2 荧光定量PCR25-26
• 6.3 间接免疫荧光法26
• 6.4 环介导等温扩增技术26
• 6.5 ELISA26-27
• 第四章 江西地区PCV2、TTSuV和PBoV的感染情况调查27-42
• 1 材料与方法27-33
• 1.1 试验材料27
• 1.2 仪器设备27-28
• 1.3 溶液的配制28
• 1.4 临床样品的采集与保存28-29
• 1.5 引物合成29
• 1.6 病毒总DNA提取29-30
• 1.7 目的片段PCR扩增与检测30-32
• 1.8 PCR产物胶回收32
• 1.9 目的基因片段的克隆32
• 1.10 重组质粒菌液PCR鉴定32-33
• 1.11 扩增片段测序鉴定33
• 2 结果33-39
• 2.1 PCV2、TTSuV和PBoV检测结果33-35
• 2.2 PCV2、TTSuV和PBoV扩增片段的测序分析35
• 2.3 不同地区PCV2、TTSuV和PBoV感染情况统计分析35-37
• 2.4 不同生长阶段PCV2、TTSuV和PBoV感染情况统计分析37
• 2.5 不同组织器官中PCV2、TTSuV和PBoV感染情况统计分析37-38
• 2.6 检测样品中PCV2、PBoV和TTSuV共感染情况统计分析38-39
• 3 讨论39-42
• 3.1 三种小DNA病毒在江西地区的感染情况39-40
• 3.2 三种小DNA病毒在不同生长阶段猪中的检测40-41
• 3.3 三种小DNA病毒在不同组织器官中的检测41
• 3.4 三种小DNA病毒之间的共感染41-42
• 第五章 PBoV江西分离株NP1基因的克隆、测序及分析42-51
• 1 材料42
• 1.1 样品来源42
• 1.2 试剂42
• 1.3 仪器设备42
• 2 方法42-46
• 2.1 引物设计42-43
• 2.2 总DNA的提取43
• 2.3 PBoV NP1基因扩增43
• 2.4 胶回收43
• 2.5 T-A克隆43
• 2.6 重组质粒菌液PCR鉴定43-44
• 2.7 PBoV NP1基因阳性克隆菌液的序列测定44
• 2.8 PBoV NP1基因序列进化树的构建44-46
• 2.9 PBoV NP1基因编码蛋白质性质、结构以及功能预测46
• 3 结果46-50
• 3.1 样品PBoV NP1基因PCR扩增结果46-47
• 3.2 PBoV NP1基因进化树的构建47-48
• 3.3 PBoV NP1基因编码蛋白质性质、结构以及功能分析48-50
• 4 讨论50-51
• 全文结论51-52
• 参考文献52-62
• 致谢62-63
• 附录63-65

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：1005668