硒对绵羊睾丸间质细胞体外增殖及睾酮分泌的影响

发布时间：2017-10-13 07:24

  本文关键词：硒对绵羊睾丸间质细胞体外增殖及睾酮分泌的影响

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【摘要】：[目的]硒是动物生命活动过程中所必需的微量元素,对维持正常的细胞功能和生理过程具有重要的作用。近年来,大量研究表明硒对雄性动物的繁殖性能有重要影响,且参与调节精子发生过程中生精细胞的增殖和凋亡。目前关于硒对绵羊睾丸间质细胞的作用鲜有报道。本试验在绵羊睾丸间质细胞培养液中添加不同浓度的硒,研究硒对绵羊睾丸间质细胞体外增殖和睾酮分泌的影响,并进一步探究硒调节间质细胞睾酮合成的分子机制,以期为阐明硒对雄性动物精子发生的调控作用提供一定的实验依据。[方法]将绵羊睾丸间质细胞在不同硒浓度的培养液中培养48 h后,使用MTT鉴定睾丸间质细胞的增殖情况；使用流式细胞仪检测凋亡细胞数目；采用比色法测定睾丸间质细胞总SOD和GSH-Px活力及ROS含量；采用ELISA方法检测睾丸间质细胞睾酮分泌情况；采用荧光定量方法检测细胞周期与凋亡及睾酮合成相关基因的表达情况；采用western blot方法检测细胞周期及睾酮合成相关蛋白和ERK1/2蛋白的表达情况。[结果]随着培养液中硒含量的增加,睾丸间质细胞的增殖率逐渐降低,但2μmol/L组与4μmol/L组差异不显著(P＜0.05)。各处理组中凋亡细胞数差异显著(P0.05),且随着硒浓度的升高而增加。随着硒含量的增加,CASPASE 3. CASPASE 8.P21、P53的mRNA表达量逐渐升高；P21和P53的蛋白表达量逐渐升高；CDKl的mRNA和蛋白表达量逐渐降低；但是P27的mRNA和蛋白表达水平在各处理组中均差异不显著。对照组的增殖率显著低于2 μmol/L组(Pl0.05),但对照组与2 μmol/L组的凋亡数差异不显著。GSH-Px在2 μmol/L组的活性显著高于对照组(P＜0.05)。ROS在8 μmol/L组的含量显著高于其它组(P＜0.05)。睾酮合成量呈现先上升后下降的趋势,且2μmol/L处理组合成量显著高于对照组和8 μmol/L处理组(P0.05),睾酮合成相关基因StAR和3β-HSD在2 μmol/L组的mRNA及蛋白表达量显著高于其它组(P0.05)。在对照组和2μmol/L组中,绵羊睾丸间质细胞内ERKl/2蛋白表达水平差异不显著,但2μmol/L处理可显著提高P-ERK1/2蛋白表达水平(P0.05)。添加抑制剂PD0325901处理组中睾酮合成量显著低于未添加组(P0.05)。同时添加抑制剂后,2 μmol/L组间质细胞睾酮合成量和3β-HSD、StAR表达量与对照组差异不显著。[结论]硒能调控抗氧化酶活性和细胞周期及凋亡相关基因的表达,参与调节睾丸间质细胞的增殖与凋亡。硒可通过ERK信号通路调节睾酮合成相关基因(StAR、3β-HSD)的表达,从而影响绵羊睾丸间质细胞中睾酮的合成。
【关键词】：硒 增殖 凋亡 睾酮 ERK通路 睾丸间质细胞
【学位授予单位】：山西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S826
【目录】：

• 摘要8-9
• 前言9-10
• 第一章 文献综述10-18
• 1 硒与雄性动物生殖10-12
• 1.1 硒与精子发生10-12
• 1.2 硒与间质细胞12
• 2 睾丸间质细胞与精子发生12-14
• 2.1 睾酮与精子发生12-13
• 2.2 睾酮的生物合成13-14
• 3 睾酮分泌的调控14-17
• 3.1 下丘脑、垂体分泌激素对睾丸间质细胞的调节作用14-15
• 3.2 微量元素对睾丸间质细胞的影响15
• 3.3 MAPK-ERK信号通路15-17
• 4 小结17-18
• 第二章 硒对绵羊睾丸间质细胞体外增殖及凋亡的影响18-39
• 1 材料与方法18-27
• 1.1 试验材料18-20
• 1.1.1 试验动物与样品采集18
• 1.1.2 主要仪器设备18-19
• 1.1.3 主要试剂19
• 1.1.4 试剂的配制19-20
• 1.2 试验方法20-27
• 1.2.1 绵羊睾丸间质细胞的收集20
• 1.2.2 活细胞计数20-21
• 1.2.3 差异贴壁法纯化21
• 1.2.4 睾丸间质细胞接种21
• 1.2.5 绵羊睾丸间质细胞的鉴定21
• 1.2.6 细胞培养21
• 1.2.7 绵羊睾丸间质细胞增殖测定21-22
• 1.2.8 绵羊睾丸间质细胞凋亡检测22
• 1.2.9 超氧化物歧化酶(SOD)测定22
• 1.2.10 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定22-23
• 1.2.11 活性氧(ROS)测定23-24
• 1.2.12 Real-time PCR24-26
• 1.2.13 Western blot26-27
• 1.2.14 数据分析27
• 2 结果与分析27-36
• 2.1 睾丸间质细胞形态观察27-28
• 2.2 绵羊睾丸间质细胞3β-HSD染色鉴定28-29
• 2.3 硒对绵羊睾丸间质细胞增殖的影响29
• 2.4 硒对绵羊睾丸间质细胞凋亡的影响29-30
• 2.5 硒对绵羊睾丸间质细胞总SOD活性的影响30-31
• 2.6 硒对绵羊睾丸间质细胞GSH-Px活性的影响31-32
• 2.7 硒对绵羊睾丸间质细胞ROS含量的影响32
• 2.8 硒对细胞周期和凋亡相关基因表达的影响32-35
• 2.9 硒对P21、P27、P53和CDK1蛋白表达的影响35-36
• 3 讨论36-38
• 4 结论38-39
• 第三章 硒对绵羊睾丸间质细胞睾酮合成及相关信号通路的影响39-50
• 1 材料与方法39-42
• 1.1 试验材料39-40
• 1.1.1 试验动物39
• 1.1.2 主要试剂39-40
• 1.1.3 主要仪器设备40
• 1.2 试验方法40-42
• 1.2.1 样品采集40
• 1.2.2 睾丸间质细胞分离与纯化40
• 1.2.3 细胞培养40-41
• 1.2.4 睾酮测定41
• 1.2.5 Real-time PCR41-42
• 1.2.6 Western blot42
• 1.2.7 数据分析42
• 2 结果与分析42-48
• 2.1 硒对绵羊睾丸间质细胞睾酮合成的影响42-43
• 2.2 硒对3β-HSD和StAR表达的影响43-44
• 2.3 硒对3β-HSD和StAR蛋白表达的影响44-45
• 2.4 硒对绵羊睾丸间质细胞ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表达的影响45
• 2.5 ERK通路对绵羊睾丸间质细胞睾酮合成及相关蛋白表达的影响45-47
• 2.6 ERK通路在硒调控睾酮合成及相关蛋白表达中的作用47-48
• 3 讨论48-49
• 4 结论49-50
• 全文结论50-51
• 参考文献51-58
• 附录：硕士期间发表论文及获奖情况58-60
• Abstract60-62
• 致谢62

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本文编号：1023550