L-抗坏血酸对小鼠卵母细胞和胚胎发育的作用及其机制研究

发布时间：2017-10-13 10:19

  本文关键词：L-抗坏血酸对小鼠卵母细胞和胚胎发育的作用及其机制研究

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【摘要】：获取高质量成熟的卵母细胞和胚胎是进行人工辅助生殖和动物生产的关键。相对于体内自然发育的条件,体外培养条件会导致卵母细胞和胚胎在成熟和发育过程中出现异常的表观遗传修饰,从而会导致卵母细胞和胚胎发育率以及发育质量的下降,严重的甚至会引起卵母细胞和胚胎的死亡；维生素C是人类必需的营养物质,最近的研究发现它能广泛地影响表观遗传修饰,并且可以提高胚胎的发育率。然而,维生素C在卵母细胞减数分裂成熟过程中的作用及其影响胚胎发育的机理仍有待研究。例如：维生素C能否影响小鼠卵母细胞的发育率、提高小鼠卵母细胞和胚胎的发育质量、改善因体外培养条件而带来的异常的表观遗传修饰等。本实验利用卵母细胞和胚胎体外细胞培养、细胞免疫荧光、Western blot、实时荧光定量PCR等技术,检测了维生素C对于小鼠卵母细胞和胚胎体外培养发育的影响,探讨了L-Ascorbic acid对小鼠卵母细胞和胚胎体外培养最佳的处理浓度。主要实验结果如下：1.不同浓度的L-Ascorbic acid处理小鼠卵母细胞后,导致GVBD率都出现了下降；50ug/ml处理组显著提高了第一极体排放率(P0.05)：100uf/ml处理组显著降低了第一极体排放率(P0.05)；200ug/ml和1000ug/ml显著降低了GVBD率(P0.05)；2.免疫荧光结果显示：100ug/mlL-Ascorbic acid处理卵母细胞,导致了染色体排列出现异常,排列较为松散：200ug/ml和1000ug/mlL-Ascorbic acid处理卵母细胞后,染色体排列出现了明显的异常,纺锤体组装也出现了异常；3.不同浓度的L-Ascorbic acid处理小鼠卵母细胞后,各个处理组甲基化蛋白DNMT1表达量均出现上升；100ug/ml处理浓度开始差异性显著(P0.05)；小鼠卵母细胞5-mc免疫荧光结果图显示,200ug/ml和1000ug/ml处理均能显著提高卵母细胞5-mc水平(P0.05)；4.体内成熟卵母细胞纺锤体检验点蛋白BubRl低于体外培养的小鼠卵母细胞；50 ug/ml处理显著性的降低体外培养卵母细胞BubRl蛋白的表达量,接近于体内BubR1蛋白的表达量；100 ug/ml处理组和1000ug/ml处理组著地降低了体外培养卵母细胞纺锤体检验点相关蛋白BubRl蛋白的表达量(P0.01)；5.不同浓度的L-Ascorbic acid处理对体外培养卵母细胞通路蛋白P-ERK表达量的影响：50ug/mlL-Ascorbic acid处理组降低了P-ERK表达量；100ug/ml处理浓度开始,P-ERK蛋白的表达量显著的上升(P0.05)；6. RT-PCR结果显示小鼠卵母细胞中主要起作用的去甲基化基因是TET3,不同浓度的L-Ascorbic acid处理小鼠卵母细胞后,甲基化基因DNMT1和去甲基化基因TET3的mRNA水平均上升；全能性基因Kif4的mRNA水平均下降； 100ug/ml处理后OCT4mRNA水平高于对照组,但差异性不显著；其他处理组mRNA水平均下降；7.2cell时期体内胚胎5-mc水平高于体外培养胚胎,5-hmc水平体内胚胎显著高于体外培养胚胎(P0.05)；8cel1、Morula、Blastula时期体外培养胚胎5-mc水平显著高于体内胚胎(P0.01)；8cel1、Blastula时期体外培养胚胎5-hmc水平显著高于体内胚胎(P0.01),Morula时期体外培养胚胎5-hmc水平高于体内胚胎,差异不显著；8.Morula时期,体内胚胎去甲基化基因TET2 mRNA水平要显著高于体外培养胚胎(P0.05)；TET3主要在2ce11时期起作用,体内胚胎TET3 mRNA的水平显著高于体外培养胚胎(P0.05)；9.50ug/ml浓度L-Ascorbic acid可以显著提高2ce11、8ce11(P0.05)；Morula、 Blastula(P0.01)时期的胚胎发育率。
【关键词】：L-Ascorbic acid 小鼠卵母细胞 胚胎发育 DNA甲基化 表观遗传
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S814
【目录】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 缩略词表(Abbreviation)11-12
• 1 前言12-25
• 1.1 表观遗传调控概述13-16
• 1.1.1 DNA甲基化和去甲基化13-14
• 1.1.2 组蛋白乙酰化14-15
• 1.1.3 X染色体失活15-16
• 1.2 小鼠卵母细胞减数分裂概述16-20
• 1.2.1 小鼠卵母细胞减数分裂16-17
• 1.2.2 调控卵母细胞减数分裂的蛋白因子17-20
• 1.3 维生素C的研究概况20-24
• 1.3.1 维生素C的简介20-21
• 1.3.2 维生素C的生理功能21
• 1.3.3 维生素C与表观遗传调控的研究进展21-23
• 1.3.4 维生素C应用前景与展望23-24
• 1.4 研究的目的与意义24-25
• 2 材料和方法25-39
• 2.1 实验技术路线图25
• 2.2 实验材料25-30
• 2.2.1 实验动物25-26
• 2.2.2 主要仪器设备26-27
• 2.2.3 实验试剂药品27
• 2.2.4 主要试剂配制27-29
• 2.2.5 RT-PCR引物29-30
• 2.3 试验方法30-38
• 2.3.1 小鼠卵母细胞收集及培养30-31
• 2.3.2 小鼠胚胎获取与培养31-32
• 2.3.3 小鼠卵母细胞和胚胎5-mc、5-hmc免疫荧光32-34
• 2.3.4 卵母细胞总cDNA的获取34-35
• 2.3.5 RT-PCR检测35-37
• 2.3.6 WB检测卵母细胞相关蛋白表达37-38
• 2.4 数据统计38-39
• 3 结果与分析39-52
• 3.1 L-Ascorbic acid对小鼠卵母细胞体外发育的影响39-40
• 3.2 L-Ascorbic acid对小鼠卵母细胞染色体动态和微管蛋白的影响40-41
• 3.3 L-Ascorbic acid对小鼠卵母细胞DNA甲基化水平的影响41-43
• 3.3.1 L-Ascorbic acid对小鼠卵母细胞DNA甲基化相关蛋白的影响41-42
• 3.3.2 L-Ascorbic acid对小鼠卵母细胞5-me免疫荧光检测42-43
• 3.4 L-Ascorbic acid对小鼠卵母细胞纺锤体检验点相关蛋白的影响43-44
• 3.5 L-Ascorbic acid对小鼠卵母细胞信号通路相关蛋白P-ERK的影响44-45
• 3.6 RT-PCR检测L-Ascorbic acid处理小鼠卵母细胞相关基因mRNA水平表达45-46
• 3.6.1 去甲基化相关基因TET家族和DNMT1mRNA水平表达45-46
• 3.6.2 L-Ascorbic acid处理小鼠卵母细全能性基因mRNA水平表达46
• 3.7 体内胚胎和体外胚胎5-me和5-hmc差异性比较46-49
• 3.7.1 体外培养胚胎和体内胚胎5-mc差异性比较47-48
• 3.7.2 体外培养胚胎和体内胚胎5-hmc差异性比较48-49
• 3.8 RT-PCR检测胚胎去甲基化基因mRNA的表达49
• 3.9 L-Ascorbic acid对小鼠胚胎发育率的影响49-52
• 4 讨论52-59
• 4.1 L-Ascorbic Acid影响小鼠卵母细胞体外发育相关机理的探讨52-58
• 4.1.1 体外培养条件对卵母细胞发育成熟的影响52-54
• 4.1.2 L-Ascorbic Acid对小鼠卵母细胞发育率、染色体及纺锤体动态的影响54-55
• 4.1.3 L-Ascorbic Acid对小鼠卵母细胞DNA甲基化影响机理的探讨55-56
• 4.1.4 L-Ascorbic Acid对小鼠卵母细胞纺锤体检验点和信号通路机理影响的探讨56-57
• 4.1.5 小结57-58
• 4.2 L-Ascorbic Acid影响小鼠胚胎体外发育相关机理的探讨58-59
• 5 小结59-61
• 5.1 主要结论59-60
• 5.2 本研究的创新点60
• 5.3 需要进一步研究的相关问题60-61
• 参考文献61-72
• 致谢72

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