猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒感染猪肺泡巨噬细胞差异蛋白的筛选及验证

发布时间：2017-10-13 23:05

  本文关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒感染猪肺泡巨噬细胞差异蛋白的筛选及验证

  更多相关文章： PRRSV 强弱毒株 重组病毒 PAM细胞 膜蛋白 质谱分析

【摘要】：猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus,PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸障碍为特征的急性传染病。1987年,该病在美国首次报道。2006年,中国爆发高致病性PRRS,除了经典症状以外,以高致病率与高死亡率为主要特点。PRRSV为单股正链RNA病毒,属于套式病毒目,动脉炎病毒科,动脉炎病毒属;基因组在核糖体移码框的作用下转录并翻译为pp1a与pp1ab两段多肽,并在其自身产生的水解酶的作用下,将这两条多肽链消化产生多于12种非结构蛋白,这些非结构蛋白会参与结构蛋白的合成,与此同时,产生的结构蛋白与非结构蛋白会一同协作,参与病毒感染宿主细胞的过程。PRRSV具有严格的细胞嗜性,在患猪体内病毒主要靶细胞是肺泡巨噬细胞(PAM)以及不同组织的单核巨噬细胞,不同毒力的毒株感染PAM效率有显著差异,导致这种差异的机制尚不清楚。本研究以高致病性PRRSV HuN4强毒株与其传代致弱的HuN4-F112弱毒株为参考毒株,构建重组EGFP-PRRSV强弱毒感染性克隆,感染和纯化PAM,进行定性蛋白质谱分析;同时以其亲本强弱毒感染宿主PAM细胞膜蛋白进行定量蛋白质谱分析,筛选及验证与病毒相互作用PAM细胞膜差异蛋白,可揭示PRRSV不同毒力毒株感染细胞效率差异的分子基础,为PRRSV致病机制的研究提供理论依据。为了纯化和筛选与PRRSV相互作用的宿主细胞膜蛋白,本研究首先分别构建了含增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组PRRSV强弱毒感染性克隆,作为指示病毒,为筛选及验证与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白提供技术支撑。以PRRSV HuN4感染性克隆以及其传代致弱毒株HuN4-F112感染性克隆为骨架,利用反向遗传操作技术,在其病毒基因组ORF1b和ORF2a之间插入egfp基因,并在外源基因3?端下游插入该病毒的转录调控序列6(TRS6),构建重组病毒感染性分子克隆pHuN4-EGFP和pHuN4-F112-EGFP,并通过转染拯救出重组病毒。在MARC-145细胞中,将重组病毒连续传代,其外源egfp基因仍能够持续表达,表明该重组病毒具有良好的遗传稳定性。重组病毒在病毒滴度、噬斑形态、生长能力等方面与亲本毒无明显差异。在获得具有能够持续表达绿色荧光蛋白的重组PRRSV强弱毒之后,将强弱毒重组病毒分别感染PAM,纯化PAM,提取细胞膜蛋白进行定性蛋白质谱分析,筛选及验证与病毒相互作用PAM细胞膜差异蛋白。结果表明,在分选流式仪的FITC通道中,可获得强弱重组病毒感染PAM而产生的绿色荧光信号,分选出重组病毒感染的PAM,获得了纯化的细胞膜蛋白,利用Shotgun方法进行了膜蛋白定性蛋白质谱分析,获得的蛋白信息进行GO注释,并按蛋白分类分析,筛选出强弱毒差异蛋白93个。对选择的5个相关蛋白进行标签融合和真核上调表达试验,发现Apolipoprotein M、JUP、Apolipoprotein A-IV和Kexin type9对强毒存在抑制作用,推测为抵御PRRSV感染的宿主蛋白;Clusterin isoform x1对强毒的感染存在上调作用,推测可能是PRRSV感染的宿主受体蛋白。以其亲本强弱毒感染宿主PAM细胞膜蛋白进行了定量蛋白质谱分析,筛选及验证了与病毒相互作用PAM细胞膜差异蛋白。结果表明,通过Label-free定量蛋白质组分析,获得差异蛋白95个,其中确定定位在膜上26个;通过Western Blot验证了KDEL受体以及Histone H3蛋白,发现与质谱结果中强弱毒组检测结果一致,证明了质谱的可靠性;通过String analysis方法寻找强弱毒之间的差异感染机制,揭示了不同毒力PRRSV感染PAM的差异潜在信号通路。
【关键词】：PRRSV 强弱毒株 重组病毒 PAM细胞 膜蛋白 质谱分析
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-14
• 第一章 引言14-27
• 1.1 PRRSV病原学概述14-21
• 1.1.1 病毒的基因组结构特征15
• 1.1.2 病毒的编码的蛋白15-17
• 1.1.3 病毒感染细胞机制17-19
• 1.1.4 PRRSV进入宿主细胞RIG-I信号通路19-20
• 1.1.5 PRRSV进入宿主细胞TLR3信号通路20
• 1.1.6 PRRSV进入宿主细胞NF-κB信号通路20-21
• 1.2 反向遗传操作技术21-23
• 1.2.1 RNA病毒反向遗传学技术21-22
• 1.2.2 RNA病毒反向遗传学的研究进展22
• 1.2.3 PRRSV反向遗传学的研究进展22-23
• 1.3 分选流式细胞术23-24
• 1.3.1 流式细胞术的原理23
• 1.3.2 流式细胞术的研究进展23-24
• 1.4 蛋白质组学概述24-26
• 1.4.1 常用的蛋白质组学研究技术24-26
• 1.4.2 Shotgun定性质谱的研究进展26
• 1.4.3 Label-free定量质谱的研究进展26
• 1.5 研究目的和意义26-27
• 第二章 重组EGFP猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆的构建27-36
• 2.1 实验材料27-28
• 2.1.1 病毒株27
• 2.1.2 细胞27
• 2.1.3 主要试剂27-28
• 2.1.4 主要仪器设备28
• 2.1.5 引物及设计28
• 2.2 实验方法28-31
• 2.2.1 重组病毒感染性克隆的构建28-29
• 2.2.2 病毒拯救及纯化传代29
• 2.2.3 重组病毒的PCR鉴定29-30
• 2.2.4 重组病毒报告基因表达的鉴定30
• 2.2.5 重组病毒的间接免疫荧光的鉴定30
• 2.2.6 重组病毒的生物学特性鉴定30-31
• 2.3 结果31-35
• 2.3.1 EGFP重组PRRSV的全长克隆的构建与感染性检测31-33
• 2.3.2 重组病毒与亲本病毒结构蛋白表达分析结果33
• 2.3.3 重组病毒与亲本病毒的生物学特征分析结果33-35
• 2.4 讨论35-36
• 第三章与PRRSV相互作用的PAM细胞膜蛋白的筛选及验证36-58
• 3.1 材料36-37
• 3.1.1 病毒株36
• 3.1.2 细胞36
• 3.1.3 主要试剂36-37
• 3.1.4 主要仪器设备37
• 3.2 方法37-42
• 3.2.1 PAM细胞分离培养37
• 3.2.2 Shotgun质谱分析重组病毒感染PAM细胞的制备37-38
• 3.2.3 Label-free质谱分析亲本病毒感染PAM细胞的制备38
• 3.2.4 Shotgun定性质谱分析38-39
• 3.2.5 Label-free定量质谱分析39-41
• 3.2.6 Shotgun质谱分析目的蛋白的过表达验证41-42
• 3.2.7 Label-free质谱分析目的蛋白WB验证42
• 3.3 结果42-51
• 3.3.1 PAM细胞的分离培养42-43
• 3.3.2 重组病毒感染PAM细胞43-44
• 3.3.3 绿色荧光信号检测44
• 3.3.4 Shotgun定性质谱分析结果44-46
• 3.3.5 Label-free定量质谱分析结果46-50
• 3.3.6 Shotgun质谱分析目的蛋白的过表达验证结果50
• 3.3.7 Label-free质谱分析目的蛋白的WB验证结果50-51
• 3.4 讨论51-58
• 第四章 全文总结58-59
• 参考文献59-67
• 致谢67-68
• 作者简介68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 刘小林;;蛋白质组学及其研究进展[J];安徽农业科学;2007年31期

2 孙志;王金勇;张建武;秦爱健;袁世山;;猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)3′末端非翻译区中调控序列的研究[J];微生物学报;2007年05期

3 陈伟;游向荣;龙强;李燕;;蛋白质组学研究方法与技术[J];福建果树;2006年04期

4 胡志远,贺福初;蛋白质组研究进展[J];生物化学与生物物理进展;1999年03期

，

本文编号：1027567