miR-36f对猪蛔虫幼虫发育的调控及其靶基因核酸疫苗免疫效果评价

发布时间：2017-10-13 23:22

  本文关键词：miR-36f对猪蛔虫幼虫发育的调控及其靶基因核酸疫苗免疫效果评价

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【摘要】：猪蛔虫(Ascaris suum)在分类上属于蛔虫目(Ascaridida),蛔虫科(Ascarididae),蛔虫属(Ascaris),成虫寄生于猪的小肠,是猪肠道中最大的寄生线虫,呈世界性分布。就猪蛔虫的危害而言,一方面,猪蛔虫寄生消耗宿主营养,数量巨大时导致肠道堵塞;另一方面,猪蛔虫幼虫移行会对宿主器官造成机械性损伤。虽然化学药物可以实现蛔虫病治疗,但由于长期对药物的依赖以及不科学地使用,也造成了寄生虫抗药性的产生以及动物产品药物残留问题。随着人们对环境保护和食品健康的要求和关注度越来越高,开发新的、环境友好型、无残留抗寄生虫药物越发显重要。MicroRNA(miRNA)是细胞内一类非编码小分子RNA,在转录后水平上调控基因的表达。研究已经证实,miRNA作为转录后调控因子在调节寄生虫发育方面有着不可或缺的作用,提示我们可以从miRNA角度出发,寻找防控寄生虫的新方法。DNA疫苗又称裸DNA疫苗,是将具有抗原性的蛋白基因克隆到真核表达载体,然后将此重组的DNA通过注射等方式导入机体内,在机体内表达抗原蛋白,使机体获得免疫保护的一种新型疫苗。由于DNA疫苗不仅能够刺激机体产生体液免疫应答,还能像减毒活疫苗一样诱导机体产生细胞免疫,并且其安全性良好,所以近年来越来越受到研究者的关注。有鉴于此,本论文工作开展了以下两方面的工作:1.初步评价了asu-miR-36f对猪蛔虫幼虫发育及感染性的影响。本实验室前期通过对猪蛔虫发育史miRNA表达谱分析发现asu-miR-36f只在猪蛔虫的卵和幼虫期特异表达,而在其他时期不表达,表明此miRNA在猪蛔虫的早期发育可能有重要作用。因此,我们设计、合成了miRNA模拟物(mimics)和抑制剂(inhibitor),并通过浸泡的方法来导入幼虫体内,检测asu-miR-36f以及其两个关键靶基因(OST48和Cyb)的表达量;然后将处理过的幼虫感染小鼠并进行了幼虫回收和计数,初步探讨其对猪蛔虫幼虫发育和感染性的影响。结果发现:跟对照相比,抑制剂组回收幼虫的数量、长度和宽度差异显著,可能是由于在抑制剂的作用下,asu-miR-36f在幼虫体内的水平下降,对某些靶基因的抑制作用减弱,从而对某些通路产生了影响,进而对幼虫的发育产生了影响。经过模拟物处理实验组的回收幼虫的数量、回收虫体的长度和宽度与其他对照组相比差异不显著,提示虫体内的miRNA功能的发挥可能依赖一定的阈值限制,当miRNA的水平高于这个阈值的时候,随着miRNA水平的升高,miRNA的功能不再明显加强。本实验同时证明通过浸泡的方法可以有效地将miRNA导入到线虫体内。与基因枪、显微注射等方法相比,此方法有简单易行,对虫体损伤小等优点。2.构建pVAX-AG、pVAX-NCS核酸疫苗,评价其免疫效果。通过生物信息学分析,我们在众多asu-miR-36f的靶基因中选择了两个猪蛔虫特有的靶基因。将这两个靶基因,通过PCR克隆、酶切、连接pET30a质粒、转化DH5α、测序验证,并进行BL21(DE3)原核表达后制备小鼠免疫多抗,在此基础上构建了pVAX 1.0重组质粒,并通过间接免疫荧光法、Western blot证实了构建的两个真核重组质粒能够在真核细胞表达,随后进行质粒大量制备,通过注射方法免疫小鼠,检测抗体水平、细胞因子水平、攻虫实验等指标检测了小鼠血清中IgG抗体及IgG1、IgG2a抗体亚类、CD3+CD4+CD8-和CD3+CD8+CD4-细胞含量、细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、和IL-10等,综合评价了构建的DNA疫苗的免疫保护性作用。结果表明:pVAX-NCS可以有效地诱导实验小鼠产生体液免疫应答和细胞免疫应答,最终的减虫率达35.96%;而pVAX-AG也可以引起实验小鼠产生体液免疫应答和细胞免疫应答,但是较弱,实验组的减虫率也不及pVAX-NCS组。提示pVAX-NCS对小鼠具有较好的免疫保护作用。综上所述,本研究初步评价了asu-miR-36f对猪蛔虫幼虫发育的影响,并利用其靶基因成功构建了DNA疫苗,为猪蛔虫DNA疫苗的研究奠定了基础。同时,因为miR-36f也发现存在于其它蠕虫,故本研究构建的DNA疫苗对于其它蠕虫病防控也具有良好参考价值。
【关键词】：猪蛔虫 microRNA 核酸疫苗 免疫保护
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 英文缩写对照表11-12
• 第一章 文献综述12-19
• 1.1 引言12-13
• 1.2 miR-36的研究进展13-16
• 1.2.1 miR-36基因簇特征13
• 1.2.2 miR-36的进化及序列特征分析13-14
• 1.2.3 miR-36研究进展14-16
• 1.2.4 小结与展望16
• 1.3 DNA疫苗研究进展16-19
• 1.3.1 DNA疫苗简介16-17
• 1.3.2 DNA疫苗的研究进展17-19
• 第二章 Asu-miR-36f抗猪蛔虫幼虫感染的效果评价19-28
• 2.1 材料与方法19-24
• 2.1.1 实验动物19
• 2.1.2 猪蛔虫三期幼虫的培养19-20
• 2.1.3 仪器及试剂20
• 2.1.4 培养基的配制20
• 2.1.5 感染性虫卵的体外脱壳20-21
• 2.1.6 虫卵计数21
• 2.1.7 asu-miR-36f模拟物, 抑制剂及其对照溶液的配制21
• 2.1.8 浸泡三期幼虫21
• 2.1.9 攻虫实验21
• 2.1.10 检测asu-miR-36f及OST48和Cyb表达量21-24
• 2.2 结果24-27
• 2.2.1 猪蛔虫受精卵培养至第三期幼虫24-25
• 2.2.2 提RNA纯度检测25
• 2.2.3 asu-miR-36f靶基因的荧光定量结果25-26
• 2.2.4 统计回收幼虫的数目及长度和宽度结果26-27
• 2.3 讨论27-28
• 第三章 pVAX -NCS、pVAX-AG的制备及免疫效果评价28-63
• 3.1 材料28-34
• 3.1.1 实验动物28
• 3.1.2 质粒、菌株和细胞28
• 3.1.3 主要试剂28-29
• 3.1.4 主要设备及仪器29
• 3.1.5 主要溶液配制29-32
• 3.1.6 培养基的配制32-34
• 3.2 方法34-48
• 3.2.1 猪蛔虫总cDNA的获取34-35
• 3.2.2 目的基因的原核表达与阳性血清的制备35-40
• 3.2.3 目的片段与pVAX1.0 真核表达载体的连接40-43
• 3.2.4 重组质粒pVAX-AG、pVAX-NCS的体外表达验证43-44
• 3.2.5 pVAX1.0 及重组质粒pVAX-AG、pVAX-NCS的大量制备44-45
• 3.2.6 重组质粒的免疫效果评价45-48
• 3.3 结果48-60
• 3.3.1 AG基因和NCS基因的原核表达48-53
• 3.3.2 pVAX-AG、pVAX-NCS重组质粒的构建53-56
• 3.3.3 重组质粒pVAX-AG、pVAX-NCS的体外表达验证56-57
• 3.3.4 重组质粒的免疫效果评价57-60
• 3.4 讨论60-63
• 第四章 全文总结63-64
• 参考文献64-70
• 致谢70-71
• 作者简介71-72

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本文编号：1027656