副猪嗜血杆菌sapA基因的鉴定与生物学特性研究

发布时间：2017-10-14 07:12

  本文关键词：副猪嗜血杆菌sapA基因的鉴定与生物学特性研究

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【摘要】：副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS),革兰氏阴性杆菌,属于巴斯德杆菌科嗜血杆菌属。研究表明抗菌肽敏感基因sapA在多种革兰氏阴性菌中对阻断抗菌肽有重要作用,在与HPS同科同属的流感嗜血杆菌、杜克雷嗜血杆菌中,sapA基因已被证实是一个重要的毒力因子,而目前对于该基因在HPS的情况尚未有研究报道。本研究对从患病猪肺组织中分离到的HPS菌株H31(血清12型强毒菌株)进行了sapA基因的克隆与测序,运用生物信息学软件预测发现该菌sapA基因编码蛋白具有丰富的二级结构和良好的抗原性;鉴定并分析了sapA基因在66株HPS中的分布情况,发现仅29株存在该基因,推测该基因只存在于毒力菌株中,但由于所选用菌株数量有限,该结果需进一步确认研究;测序并分析了29个sapA基因表明该基因在不同菌株中高度同源。构建了sapA基因原核表达载体pET-32a(sapA)并摸索优化了表达条件,大量表达、纯化了一批具有生物学活性的sapA蛋白(浓度195μg/mL);制备了sapA蛋白兔抗高免血清并建立了间接ELISA检测血清sapA蛋白抗体的方法;间接ELISA、western blot检测发现sapA蛋白能够很好地识别H31血清,表明具有良好的免疫原性;间接免疫荧光法、western blot法发现提取的H31细菌胞质蛋白能够与sapA蛋白高免血清发生特异性免疫印迹反应,表明sapA蛋白存在于细菌细胞胞质中;血清杀菌试验发现sapA蛋白血清作用下细菌存活率较阴性对照有明显提高,表明sapA蛋白抗体促进细菌繁殖生长;sapA蛋白阻断试验发现sapA蛋白对抗菌肽杀菌有良好的阻断作用,且阻断后一定程度上促进了细菌的生长,推测sapA蛋白结合了抗菌肽并将其分解成氨基酸以供细菌生长利用,促进了细菌的生长繁殖。动物试验发现高水平sapA蛋白抗体加剧了豚鼠在HPS攻毒后的发病与死亡,验证了血清杀菌试验结果,证明sapA基因是一个重要的毒力因子。本文首次对HPS的sapA基因进行了鉴定和研究,分析、预测了其序列和编码蛋白特性,并成功构建了原核表达载体,高效表达、纯化得到了一批具有生物学活性的sapA融合表达蛋白。鉴定了蛋白的免疫原性,定位了蛋白的细菌亚细胞位置,体外试验验证了sapA蛋白血清的杀菌效应和sapA蛋白阻断抗菌肽杀菌效应,体内试验验证了sapA基因是HPS的一个重要的毒力因子。为以后副猪嗜血杆菌sapA基因的研究以及疫苗的开发提供参考。
【关键词】：副猪嗜血杆菌 sapA基因 克隆分析 蛋白生物学特性
【学位授予单位】：仲恺农业工程学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 缩略 词8-12
• 第一章 绪论12-18
• 1.1 副猪嗜血杆菌简述12-14
• 1.1.1 病原学12
• 1.1.2 流行病学12-13
• 1.1.3 HPS毒力因子的研究13-14
• 1.2 阳离子抗菌肽与sapA基因14-16
• 1.2.1 抗菌肽的来源与结构14-15
• 1.2.2 CAMPs的作用机制15
• 1.2.3 细菌抵御CAMPs杀灭作用的机制15-16
• 1.2.4 抗菌肽敏感（Sensitive of anti-microbial peptide, sap）基因16
• 1.3 研究目的与意义16-18
• 第二章 HPS sapA基因的克隆与分析18-31
• 2.1 前言18
• 2.2 材料与方法18-23
• 2.2.1 实验材料18-19
• 2.2.1.1 菌种18
• 2.2.1.2 试剂和材料18-19
• 2.2.1.3 仪器与设备19
• 2.2.2 方法19-23
• 2.2.2.1 副猪嗜血杆菌sapA基因的克隆19-20
• 2.2.2.2 pGEM-sapA克隆载体的构建20-22
• 2.2.2.3 副猪嗜血杆菌sapA基因的序列测定与分析22
• 2.2.2.4 副猪嗜血杆菌sapA基因的分布与同源性分析22-23
• 2.3 结果与分析23-29
• 2.3.1 H31 Sap A基因克隆结果23
• 2.3.2 PCR产物回收结果23-24
• 2.3.3 重组克隆载体 31A-T的PCR鉴定结果24
• 2.3.4 重组克隆载体 31A-T的双酶切鉴定结果24-25
• 2.3.5 副猪嗜血杆菌H31菌株sapA基因的测序与分析25-26
• 2.3.6 副猪嗜血杆菌不同菌株sapA基因的分布26
• 2.3.7 副猪嗜血杆菌不同菌株sapA基因的测序与分析26-29
• 2.4 讨论29-31
• 2.4.1 sapA基因的克隆与预测分析29
• 2.4.2 sapA在不同菌株中分布情况29-30
• 2.4.3 sapA在不同菌株中同源性分析30-31
• 第三章 HPS sapA基因的原核表达、纯化31-46
• 3.1 前言31
• 3.2 材料与方法31-38
• 3.2.1 材料31-32
• 3.2.1.1 菌种与载体31
• 3.2.1.2 试剂与材料31-32
• 3.2.2 方法32-38
• 3.2.2.1 试剂的配制32
• 3.2.2.2 sapA基因片段的克隆与纯化32
• 3.2.2.3 原核表达载体pET32a（sapA）的构建32-34
• 3.2.2.4 HPS sapA基因的原核表达34-36
• 3.2.2.5 融合蛋白的大量表达与纯化36-37
• 3.2.2.6 包涵体纯化蛋白的复性与浓缩37
• 3.2.2.7 蛋白浓度测定37-38
• 3.3 结果与分析38-44
• 3.3.1 pET-32a（sapA）原核表达载体的构建38-40
• 3.3.1.1 pET-32a（sapA）的PCR鉴定与双酶切鉴定38-39
• 3.3.1.2 pET-32a（sapA）转化进入受体菌E.coli BL21(DE3)的PCR鉴定39-40
• 3.3.2 sapA蛋白的诱导表达40-44
• 3.3.2.1 诱导温度对sapA蛋白表达的影响40
• 3.3.2.2 IPTG浓度对sapA蛋白表达的影响40-41
• 3.3.2.3 诱导时间对sapA蛋白表达的影响41-42
• 3.3.2.4 融合表达蛋白的可溶性分析42
• 3.3.2.5 融合表达蛋白的纯化42-43
• 3.3.2.6 sapA蛋白浓度测定43-44
• 3.4 讨论44-46
• 第四章 HPS sapA融合表达蛋白的生物学特性研究46-65
• 4.1 前言46
• 4.2 材料与方法46-53
• 4.2.1 材料试剂与实验动物46
• 4.2.2 方法46-53
• 4.2.2.1 试剂的配置46-47
• 4.2.2.2 高免血清的制备47-48
• 4.2.2.3 间接ELISA检测sapA蛋白抗体方法的建立48-50
• 4.2.2.5 sapA蛋白的细菌亚细胞定位50-52
• 4.2.2.6 sapA蛋白高免血清杀菌试验52
• 4.2.2.7 sapA蛋白阻断抗菌肽杀菌试验52-53
• 4.2.2.8 sapA蛋白的动物免疫攻毒试验53
• 4.3 结果与分析53-62
• 4.3.1 间接ELISA检测sapA蛋白抗体方法的建立53-56
• 4.3.1.1 最佳抗原包被浓度、最佳血清稀释度53-54
• 4.3.1.2 酶标二抗最佳使用浓度54
• 4.3.1.3 阴阳性临界值54-55
• 4.3.1.4 血清抗体水平监测55-56
• 4.3.2 sapA蛋白的免疫原性鉴定56-57
• 4.3.2.1 ELISA分析sapA蛋白的免疫原性56
• 4.3.2.2.western blot分析sapA蛋白的免疫原性56-57
• 4.3.3 sapA蛋白的亚细胞定位57-59
• 4.3.3.1 间接免疫荧光定位细菌表面57-58
• 4.3.3.2 western blot定位细菌亚细胞结构58-59
• 4.3.4 sapA蛋白高免血清杀菌试验59-60
• 4.3.5 sapA蛋白阻断抗菌肽杀菌试验60
• 4.3.6 sapA蛋白的动物免疫攻毒试验60-62
• 4.4 讨论62-65
• 4.4.1 间接ELISA检测血清sapA蛋白抗体方法的建立62
• 4.4.2 sapA融合蛋白的免疫原性62
• 4.4.3 sapA蛋白在副猪嗜血杆菌的亚细胞定位62-63
• 4.4.4 sapA蛋白高免血清的体外杀菌效应63
• 4.4.5 sapA蛋白阻断抗菌肽杀菌效应63-64
• 4.4.6 豚鼠免疫攻毒试验64-65
• 全文总结65-66
• 致谢66-67
• 参考文献67-70
• 攻读硕士学位期间发表论文情况70-71
• 答辩委员会对论文的评定意见71-72

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