鸡大肠杆菌菌影的制备及免疫效果研究

发布时间：2017-10-16 20:22

  本文关键词：鸡大肠杆菌菌影的制备及免疫效果研究

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【摘要】：鸡大肠杆菌病是指鸡群中由大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)所引起的局部或全身性感染的一种传染性疾病,本病在世界各地均有发生,其复杂的抗原性,众多的血清型,加之我国禽类养殖数量大、养殖水平相对较低,导致该病在畜禽之间的传播,难以防控。目前普遍使用的大肠杆菌灭活疫苗不能有效地控制该疾病的流行,所以研制新型、高效的鸡大肠杆菌疫苗势在必行。本研究利用pBV220载体的调控元件、启动子和终止子,将PhiX174噬菌体裂解基因E与金黄色葡萄球菌核酸酶A基因(SNA)通过Linker连接实现融合表达,SN基因作为辅助基因可以将细菌的核酸降解为100 bp以下的小片段,使之更易排出胞外提高裂解率。本试验成功构建了高效的重组质粒pFBDM-E-SN,采取电击穿孔法将其转化至鸡大肠杆菌感受态细胞中,在28℃条件下培养至对数生长期,然后快速升温至42℃诱导裂解基因的表达,利用平板法计算细菌的裂解率,其裂解率可高达99.9%。对O78大肠杆菌菌影疫苗进行评价研究,将50只7日龄的鸡只随机分成三组:菌影疫苗组、灭活疫苗组、对照组;菌影疫苗组和灭活疫苗组每组20只,对照组为10只,7日龄首免,间隔14d后加强免疫一次,加强免疫7天后进行攻毒,统计鸡只死亡情况,以计算保护率为指标评价菌影疫苗的保护效果。同时对一免7d、14d、二免7d后、攻毒后7d进行翅下静脉采血,分离血清,以O78大肠杆菌作为包被抗原,间接ELISA进行血清抗体的检测,评价体液免疫效果。二免疫7d后,用鸡大肠杆菌进行攻毒,观察并记录鸡死亡数量。通过鸡只存活率、内脏病理变化,体液免疫水平综合评价鸡大肠杆菌菌影疫苗的免疫保护效果。动物攻毒保护实验结果显示,菌影疫苗可以刺激机体产生比灭活疫苗更高的抗体水平,在50倍LD50的攻毒剂量下,菌影疫苗的保护效率为90%,而灭活疫苗的保护率为70%,这表明菌影疫苗比传统灭活疫苗具有更高的保护效果,并有潜力成为新的大肠杆菌疫苗类型。
【关键词】：鸡大肠杆菌 菌影 免疫效果
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.31
【目录】：

• 摘要5-6
• ABSTRACT6-9
• 文献综述9-15
• 第一章 鸡大肠杆菌病研究进展9-15
• 1.1 鸡大肠杆菌病概述9-10
• 1.2 鸡大肠杆菌疫苗的研究10
• 1.3 菌影疫苗研究进展10-15
• 1.3.1 菌影疫苗的裂解机制11-12
• 1.3.2 菌影疫苗的优势12-13
• 1.3.3 菌影疫苗的应用13
• 1.3.4 双裂解基因在菌影疫苗中的应用13-14
• 1.3.5 菌影的不足与解决措施14-15
• 试验研究15-31
• 第二章 大肠杆菌重组菌株的构建及溶菌动力学实验15-27
• 2.1 材料15-16
• 2.1.1 菌株与载体15
• 2.1.2 试剂与仪器15
• 2.1.3 培养基及电泳相关溶液15-16
• 2.2 方法16-22
• 2.2.1 合成E/SN基因16
• 2.2.2 重组质粒PBV220-E-SN的构建16-18
• 2.2.3 重组质粒pFBDM-E-SN的构建18-21
• 2.2.4 O78大肠杆菌电转化感受态细胞的制备21
• 2.2.5 电转化O78大肠杆菌感受态细胞21
• 2.2.6 电转化重组质粒的鉴定21
• 2.2.7 重组大肠杆菌的溶菌动力学实验21-22
• 2.2.8 金黄色葡萄球菌核酸酶活性检测22
• 2.3 结果22-26
• 2.3.1 成功构建重组质粒pBV220-E-SN22-23
• 2.3.2 成功构建重组质粒pFBDM-E-SN23-25
• 2.3.3 诱导后细菌生长曲线25
• 2.3.4 重组鸡大肠杆菌菌影的裂解率25
• 2.3.5 金黄色葡萄球菌核酸酶活性检测25-26
• 2.4 讨论26
• 2.5 小结26-27
• 第三章 078大肠杆菌菌影的制备及免疫效果评价27-31
• 3.1 材料27
• 3.1.1 菌株27
• 3.1.2 主要试剂及仪器27
• 3.2 方法27-28
• 3.2.1 大肠杆菌O78菌影的制备及残余活菌灭活27
• 3.2.2 安全性检验27
• 3.2.3 鸡只半数致死量试验27
• 3.2.4 鸡只免疫与攻毒27-28
• 3.2.5 血清特异性抗体检测28
• 3.3 结果28-30
• 3.3.1 无菌检测28
• 3.3.2 安全性检验28-29
• 3.3.3 O78鸡大肠杆菌LD50的测定结果29
• 3.3.4 血清中抗体水平检测结果29
• 3.3.5 攻毒后保护情况29-30
• 3.4 讨论30
• 3.5 小结30-31
• 结论31-32
• 参考文献32-34
• 致谢34-35
• 作者简介35

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本文编号：1044702