eIF4A3对流感病毒复制的影响及其作用机制研究

发布时间：2017-10-17 08:33

  本文关键词：eIF4A3对流感病毒复制的影响及其作用机制研究

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【摘要】：流感病毒属于正粘病毒科的单股负链RNA病毒,基因组分为八个节段,其中编码PA、PB1、PB2和NP蛋白的基因高度保守,且它们与流感病毒vRNA结合以后形成vRNP,主要负责流感病毒的转录与复制。流感病毒与宿主细胞相互作用构成了病毒感染、复制、致病及免疫的分子基础。因此,理解宿主因子与流感病毒的相互作用不仅有利于我们深入了解流感病毒生活周期,也有利于开发新的抗流感药物。本实验室在前期的研究中通过串联亲和纯化实验筛选到与聚合酶复合物互作的宿主蛋白eIF4A3(Eukaryotic translation initiation factor 4A isoform 3)。并且本研究证实该蛋白可以与流感病毒聚合酶亚基PB1相互作用,进一步发现该蛋白能够显著促进流感病毒的增殖,促进流感病毒的转录与复制。探究该蛋白促进流感病毒增殖的作用机制时我们发现e IF4A3过表达时可以促进流感病毒聚合酶活性,而且这种促进作用是通过提高聚合酶系统组装实现的。同时,e IF4A3干扰时可以显著抑制流感病毒vRNP核输出。这不仅拓展了现有的流感病毒与宿主因子相互作用网络,也为以后流感的防控提供了新的思路和方向。主要研究结果如下:1 eIF4A3促进流感病毒增殖本实验室在前期的研究中通过串联亲和纯化实验筛选到与流感病毒聚合酶复合物互作的宿主蛋白eIF4A3,通过检测eIF4A3干扰之后对PR8及HM流感病毒mRNA水平的影响,初步确定了eIF4A3干扰之后可以显著抑制流感病毒复制。进一步通过TCID50实验验证eIF4A3对流感病毒增殖的影响,结果与上面一致,即e IF4A3干扰之后可以显著抑制流感病毒的增殖。2流感病毒感染过程中,eIF4A3促进流感病毒转录,复制在A549细胞上将e IF4A3干扰和过表达之后感染HM,并于4h,6h,8h收样,通过荧光定量方法检测eIF4A3对流感病毒mRNA,cRNA和vRNA水平影响,同时通过Western检测该蛋白对流感病毒蛋白表达的影响。结果证实该蛋白在干扰之后可以显著抑制流感病毒复制,转录,过表达时能够显著促进流感病毒转录,复制。3 eIF4A3可以和流感病毒聚合酶亚基PB1相互作用通过Co-IP实验我们发现e IF4A3能够与流感病毒聚合酶亚基PB1发生相互作用,而与其它亚基不存在相互作用,且在感染情况下eIF4A3与内源性PB1也存在相互作用;进一步通过激光共聚焦显微镜ZEISS检测PB1与eIF4A3的亚细胞定位情况,发现两个蛋白在空间上存在共定位,主要定位于胞核。4 eIF4A3促进流感病毒聚合酶活性用293T细胞检测eIF4A3干扰与过表达时对流感病毒聚合酶活性的影响,发现该蛋白过表达可以显著促进流感病毒聚合酶活性,干扰之后可以显著抑制聚合酶活性。5在聚合酶系统中,eIF4A3可以促进流感病毒聚合酶系统组装探究eIF4A3促进流感病毒聚合酶活性的原因,我们首先将eIF4A3过表达293T细胞,24小时后Western检测该蛋白对流感病毒聚合酶各个亚基及NP蛋白表达水平的影响,发现该蛋白对各个蛋白表达均没有影响,进一步通过Co-IP实验检测eIF4A3对该聚合酶系统组装的影响时发现,与对照相比,eIF4A3可以显著促进流感病毒聚合酶系统RNP组装。6 eIF4A3干扰之后抑制流感病毒vRNP的核输出将eIF4A3干扰之后接毒HM,并于5h之后进行固定,透化,染色,利用激光共聚焦显微镜观察发现eIF4A3干扰之后可以显著抑制NP蛋白的核输出。7 eIF4A3蛋白解旋酶功能在它对流感病毒影响中发挥重要作用为研究eIF4A3蛋白解旋酶功能在它对流感病毒影响中发挥的作用,我们将该蛋白DEAD区域进行突变,通过相对荧光定量方法检测该区域突变后对流感病毒复制的影响,结果发现eIF4A3突变之后,该蛋白对流感病毒促进作用消失,变为抑制。
【关键词】：流感病毒 eIF4A3 PB1 Co-IP 聚合酶活力 RNP组装 核输出
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 缩略语表(Abbreviation)11-13
• 第1章 前言13-21
• 1.1 文献综述13-20
• 1.1.1 流感病毒简介13
• 1.1.2 流感病毒RNA聚合酶和NP蛋白13-14
• 1.1.3 流感病毒转录与复制14-17
• 1.1.4 流感病毒聚合酶与流感致病性和跨种传播关系17
• 1.1.5 流感病毒与宿主因子研究17-18
• 1.1.6 eIF4A318-20
• 1.2 研究目的与意义20-21
• 第2章 材料与方法21-32
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 细菌、细胞、病毒、质粒21
• 2.1.2 抗体21
• 2.1.3 siRNA21
• 2.1.4 主要试剂与培养基21-22
• 2.1.5 主要酶和试剂盒22
• 2.1.6 重要仪器和设备22-23
• 2.2 主要方法23-32
• 2.2.1 DNA实验23-26
• 2.2.2 RNA实验26-27
• 2.2.3 蛋白实验27-30
• 2.2.4 细胞实验30-31
• 2.2.5 统计学处理31-32
• 第3章 结果与分析32-45
• 3.1 eIF4A3的克隆与表达32-33
• 3.2 eIF4A3对流感病毒增殖的影响33-35
• 3.3 eIF4A3对流感病毒转录，复制的影响35-36
• 3.4 eIF4A3对流感病毒蛋白水平的影响36-37
• 3.5 eIF4A3与聚合酶亚基PB1相互作用37-39
• 3.6 eIF4A3与PB1的共定位情况39-40
• 3.7 eIF4A3促进流感病毒聚合酶活性40-41
• 3.8 eIF4A3促进流感病毒聚合酶组装41-43
• 3.9 eIF4A3促进流感病毒NP的核输出43
• 3.10 eIF4A3功能突变体对流感病毒增殖的影响43-45
• 第4章 讨论45-47
• 第5章 小结47-48
• 参考文献48-58
• 致谢58

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