肠外致病性大肠杆菌icmF基因功能研究和侵入脑微血管内皮细胞相关基因的筛选

发布时间：2017-10-17 18:22

  本文关键词：肠外致病性大肠杆菌icmF基因功能研究和侵入脑微血管内皮细胞相关基因的筛选

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【摘要】：肠外致病性大肠杆菌是一类在特定情况下能引起宿主肠道以外组织感染的病原菌,主要引发肺部感染、泌尿系统感染和脑膜炎等。尽管已经有很多毒力因子被报道参与了上述致病过程,但仍有许多细节未得到清楚的解释。细菌VI型分泌系统已被鉴定存在于包括肠外致病性大肠杆菌在内的多种致病菌中,在细菌致病过程中起到重要作用。本课题利用实验室前期构建的大肠杆菌VI型分泌系统基因缺失株Δhcp1-3和新构建的icmF基因缺失株ΔicmF,研究icmF基因在猪肠外致病性大肠杆菌PCN033中的作用。主要取得以下结果:(1)成功利用正反筛选系统构建了icmF基因敲除突变株,并改进了突变株的筛选方法。(2)表型实验结果显示,T6SS相关基因缺失并不影响细菌的生长、运动和抗药能力,但能显著增强细菌形成生物被膜的能力。(3)细胞实验结果显示,T6SS功能的缺失导致细菌粘附、侵入上皮细胞能力增强。另外,T6SS功能的缺失并不影响细菌对巨噬细胞的毒性,但极显著的降低了细菌抵抗巨噬细胞吞噬和在巨噬细胞内存活的能力。在所有的表型检测中,ΔicmF和Δhcp1-3的表现基本相同,可以初步认为icmF基因功能与T6SS紧密相关。为了进一步了解致脑膜炎大肠杆菌的致病机制,本研究进一步构建了脑膜炎模式菌株RS218的Tn5转座子突变体库。以人脑微血管内皮细胞为模型,筛选侵入能力缺陷的突变株。通过对764株突变株的筛选,初步获得33株侵入能力明显下降的突变株。进一步通过检测候选突变株的生长速率,筛选掉2株生长速率下降的突变株。经细胞侵入实验的复检,最终获得31株突变株对HBMEC的侵入率。采用TAIL-PCR技术,获得了Tn5插入位置一侧的基因组序列,经测序和序列分析,定位到29个基因内部插入和两个基因间插入。其中有一个突变发生在已报道参与细菌突破血脑屏障的fimH基因内。本研究的筛选结果为后续大肠杆菌致脑膜炎的机制研究奠定了基础。
【关键词】：肠外致病性大肠杆菌 icmF基因 VI型分泌系统 人脑微血管内皮细胞 转座子突变体库
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-8
• 缩略词表(Abbreviation)8-9
• 第1章 综述9-16
• 1.1 IV型分泌系统研究进展9-13
• 1.1.1 icmF基因研究进展9-10
• 1.1.2 T6SS其他结构蛋白10-11
• 1.1.3 T6SS分泌蛋白的挖掘11-12
• 1.1.4 T6SS的功能12-13
• 1.1.5 T6SS研究小结与展望13
• 1.2 大肠杆菌致脑膜炎的研究进展13-16
• 1.2.1 大肠杆菌引发脑膜炎的过程14
• 1.2.2 致脑膜炎大肠杆菌的毒力因子14-15
• 1.2.3 大肠杆菌致脑膜炎研究的小结与展望15-16
• 第2章 肠外致病性大肠杆菌icmF基因的功能研究16-33
• 2.1 目的与意义16
• 2.2 实验材料16-19
• 2.2.1 菌株、细胞与质粒16
• 2.2.2 酶和相关试剂16-17
• 2.2.3 培养基和试剂的配制17-18
• 2.2.4 仪器和设备18-19
• 2.2.5 PCR引物19
• 2.3 实验方法19-24
• 2.3.1 细菌培养和细菌基因组的提取19
• 2.3.2 基因缺失突变株 ΔicmF的构建与鉴定19-20
• 2.3.3 基因缺失突变株 ΔicmF的遗传稳定性20
• 2.3.4 基因缺失突变株 ΔicmF的生长特性20
• 2.3.5 运动能力检测20-21
• 2.3.6 生物被膜形成能力的检测21
• 2.3.7 耐药性评估21
• 2.3.8 粘附和侵入内皮细胞能力的检测21-22
• 2.3.9 抗巨噬细胞吞噬及吞噬后存活能力的检测22-23
• 2.3.10 巨噬细胞毒性的检测23-24
• 2.4 结果与分析24-30
• 2.4.1 基因缺失突变株 ΔicmF的构建与鉴定24
• 2.4.2 基因缺失突变株 ΔicmF的遗传稳定性24-25
• 2.4.3 基因缺失突变株 ΔicmF的生长特性25-26
• 2.4.4 细菌运动能力检测26
• 2.4.5 生物被膜形成能力检测26-27
• 2.4.6 耐药性测定27
• 2.4.7 粘附与侵入HBMEC能力的比较27-28
• 2.4.8 抗巨噬细胞吞噬及吞噬后存活能力检测28-29
• 2.4.9 巨噬细胞毒性检测29-30
• 2.5 讨论30-32
• 2.6 结论32-33
• 第3章 RS218突破血脑屏障相关毒力因子的筛选33-45
• 3.1 目的与意义33
• 3.2 实验材料33-34
• 3.2.1 菌株、细胞与质粒33
• 3.2.2 酶和相关试剂33
• 3.2.3 主要仪器和设备33
• 3.2.4 培养基和试剂的配制33-34
• 3.2.5 PCR引物34
• 3.3 实验方法34-37
• 3.3.1 突变体库的构建和质量检测34-35
• 3.3.2 突变株侵入HBMEC能力的初步筛选35
• 3.3.3 候选突变株生长能力的检测35
• 3.3.4 候选突变株侵入率的测定35-36
• 3.3.5 TAIL-PCR扩增Tn5侧翼序列36-37
• 3.3.6 突变位点定位37
• 3.4 结果与分析37-42
• 3.4.1 突变体库的构建和质量检测37-38
• 3.4.2 突变株侵入HBMEC能力分析38
• 3.4.3 候选突变株生长能力的检测38-39
• 3.4.4 候选突变株侵入率测定39-40
• 3.4.5 候选突变株突变位点的确定40-42
• 3.5 讨论42-44
• 3.6 结论44-45
• 参考文献45-53
• 致谢53

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