猪δ冠状病毒抑制IFN-β产生的机制研究

发布时间：2017-10-19 21:24

  本文关键词：猪δ冠状病毒抑制IFN-β产生的机制研究

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【摘要】：猪δ冠状病毒(PDCoV)属于冠状病毒科δ冠状病毒属,能造成母猪和仔猪的腹泻、呕吐、脱水,严重者可致死。自2014年初美国俄亥俄州的猪场爆发母猪和仔猪腹泻病以来,该病毒迅速传播至美国其它州以及韩国、加拿大和中国大陆,给养猪业造成了一定的经济损失。干扰素以及干扰素诱导的细胞抗病毒天然免疫应答是机体抵抗病毒入侵的重要防御机制。为了抵抗干扰素的抗病毒效应,冠状病毒在其进化过程中能采用不同的策略来逃避宿主的天然免疫反应,其中α冠状病毒、β冠状病毒以及γ冠状病毒逃避天然免疫的分子机制已经得到广泛研究,因此我们推测PDCoV也进化出了逃避抗病毒免疫反应的策略。为了揭示PDCoV感染与天然免疫之间的关系及机制,本文对PDCoV感染细胞后干扰素的产生情况及其信号通路展开了研究。具体内容如下:1.PDCoV在LLC-PK1细胞上生长特性的研究首先我们研究不同胰酶浓度的培养基对PDCoV引起LLC-PK1细胞病变的影响,结果发现PDCoV对LLC-PK1细胞的感染需要一定浓度的胰酶,且各时间点出现的病变程度和细胞脱落程度都随胰酶浓度增加而加大,其中当使用胰酶浓度为10ug/m L的培养基时,PDCoV感染的LLC-PK1细胞在24 h开始出现病变,但病变程度轻微,且无细胞脱落;同时我们还研究了PDCoV引起的细胞病变与接种剂量的关系,结果发现PDCoV引起的LLC-PK1细胞的病变时间与病变程度都随接种剂量的增加而增大,当接种量为0.01 moi时,细胞在24 h开始出现病变,但病变程度轻微,且无细胞脱落,与上述胰酶浓度摸索实验结果一致;间接免疫荧光实验结果显示PDCoV感染LLC-PK1细胞后感染率随时间的推移而增大,在感染24 h后感染率能达到较高水平且无细胞脱落;病毒滴定测定结果显示病毒滴度在感染过程中呈现逐步上升趋势,在感染24 h后病毒滴度能达到107.2 TCID50/mL。因此PDCoV感染LLC-PK1细胞后在24 h能达到较高感染率且无细胞脱落,它将作为我们后续实验所选择的最佳时间点。2.PDCoV感染后IFN-β、NF-κB和IRF3的产生情况研究采用IFN-β启动子的荧光素酶报告系统检测PDCoV感染LLC-PK1细胞之后IFN-β的表达情况,实验结果显示PDCoV感染不仅不能激活IFN-β的转录,并且还能抑制SeV或poly(I:C)诱导的IFN-β的转录,且呈现PDCoV接种剂量依赖性;进一步采用NF-κB和IRF3启动子的荧光素酶报告系统检测PDCoV感染LLC-PK1细胞之后NF-κB和IRF3的表达情况,实验结果显示PDCoV感染不能激活NF-κB和IRF3的启动子活性,并且还能抑制SeV或poly(I:C)诱导的NF-κB启动子活性和IRF3启动子活性。该结果表明PDCoV能通过抑制NF-κB和IRF3转录因子的活性从而抑制IFN-β启动子的活性。3.PDCoV抑制IFN-β产生的信号通路研究SeV和poly(I:C)是RIG-I样受体介导的IFN-β信号通路中的关键诱导物,因此我们推测PDCoV抑制SeV或poly(I:C)诱导的IFN-β产生很有可能是通过阻断了RIG-I信号通路上的某个信号分子。为了验证这种可能性及其分子机制,我们研究鉴定了PDCoV阻断SeV或poly(I:C)诱导的IFN-β转录的靶蛋白。在RIG-I信号通路的分析中,通过对RIG-I、RIG-IN、MDA5、IPS-1、TBK1、IKKε、IRF3和IRF3(5D)的超表达分析,我们发现PDCoV感染能抑制IRF3及其上游信号分子(RIG-I/RIG-IN、MDA-5、IPS-1、TBK1和IKKε)诱导的IFN-β启动子活性,但不会影响IRF3的组成激活型IRF3(5D)激活的IFN-β启动子活性,表明PDCoV能够靶向IRF3阻断RIG-I信号通路,从而抑制IFN-β的转录。4.PDCoV感染后IRF3和P65的磷酸化与核转位研究PDCoV能够抑制SeV诱导的IRF3和NF-κB的启动子活性,而磷酸化与核转位是IRF3和NF-κB(P65)活化的标志,因此我们探讨了PDCoV感染对IRF3和NF-κB的磷酸化与核转位的影响。Western blot实验结果显示,PDCoV感染能显著抑制SeV诱导的IRF3和P65的磷酸化;间接免疫荧光实验结果显示,PDCoV感染不能引起IRF3和P65发生核转位,并且还能抑制由SeV引起的IRF3和P65的核转位。表明PDCoV能通过抑制IRF3和P65的磷酸化与核转位从而来抑制SeV诱导的IRF3和NF-κB的启动子活性。
【关键词】：猪δ冠状病毒(PDCoV) 生长特性 天然免疫应答 I型干扰素 RIG-I信号通路
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 缩略语表（Abbreviation）11-13
• 第1章 文献综述13-25
• 1.1 冠状病毒简介13
• 1.2 猪 δ 冠状病毒简介13-14
• 1.3 PDCoV的流行病学与致病性14-15
• 1.4 PDCoV的体外生长特性15-17
• 1.5 PDCoV的分子生物学特征17
• 1.6 天然免疫简介17-18
• 1.7 干扰素简介18-19
• 1.8 抗病毒天然免疫19-23
• 1.8.1 RIG/MDA5介导的抗病毒天然免疫19-20
• 1.8.2 Toll样受体介导的抗病毒天然免疫20-22
• 1.8.3 Jak/STAT介导的抗病毒天然免疫22-23
• 1.9 病毒逃避天然免疫23-25
• 1.9.1 病毒逃避TLR和RIG-I/MDA5信号通路的策略23
• 1.9.2 冠状病毒逃避天然免疫的策略23-25
• 第2章 研究目的和意义25-26
• 第3章 材料和方法26-36
• 3.1 试验材料26-30
• 3.1.1 毒株与细胞26
• 3.1.2 载体与质粒26-27
• 3.1.3 主要试剂27-28
• 3.1.4 培养基及其配制28
• 3.1.5 主要缓冲液及其配制28-29
• 3.1.6 主要实验仪器及设备29-30
• 3.1.7 分子生物学分析软件30
• 3.2 实验方法30-36
• 3.2.1 质粒的小量制备30-31
• 3.2.2 质粒的大量制备31-32
• 3.2.3 质粒DNA的定量32
• 3.2.4 PDCoV的增殖32
• 3.2.5 半数细胞培养物感染量（ TCID_(50)）测定32
• 3.2.6 质粒转染32-33
• 3.2.7 双荧光素酶报告检测实验33
• 3.2.8 Western blot实验33-35
• 3.2.9 间接免疫荧光实验35
• 3.2.10 统计学方法35-36
• 第4章 结果与分析36-48
• 4.1 PDCoV在LLC-PK1细胞上的生长特性36-39
• 4.1.1 不同胰酶浓度对PDCoV生长特性的影响36-37
• 4.1.2 不同接种量的PDCoV对LLC-PK1细胞产生的病变情况37
• 4.1.3 PDCoV感染LLC-PK1细胞后感染数量随时间的变化37-39
• 4.1.4 PDCoV在LLC-PK1细胞上的一步生长曲线39
• 4.2 PDCoV抑制IFN-β 产生的分子机制研究39-48
• 4.2.1 PDCoV感染不能激活IFN-β 的转录39-40
• 4.2.2 PDCoV感染抑制SeV或poly (I:C)诱导的IFN-β 的转录40-42
• 4.2.3 PDCoV感染抑制SeV或poly (I:C)诱导的NF-κB和IRF3的活化42-43
• 4.2.4 PDCoV抑制RIG-I信号通路中IRF3的活性43-45
• 4.2.5 PDCoV感染抑制SeV诱导的IRF3和P65的磷酸化与核转位45-48
• 第5章 讨论与结论48-54
• 5.1 讨论48-52
• 5.1.1 PDCoV生长特性的研究48-50
• 5.1.2 PDCoV逃避天然免疫的分子机制50-51
• 5.1.3 PDCoV逃避天然免疫的临床意义51-52
• 5.2 结论52-54
• 参考文献54-62
• 致谢62

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本文编号：1063394