猪塞内加谷病毒（SVV）的分离鉴定及致病性研究

发布时间：2017-10-19 22:04

  本文关键词：猪塞内加谷病毒（SVV）的分离鉴定及致病性研究

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【摘要】：猪塞内加谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)属于小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)Senecavirus病毒属成员,可引起猪鼻镜及蹄冠处出现水疱、溃烂创面从而导致跛足甚至死亡。本研究采用传代细胞(猪肾细胞)从猪组织器官研磨物中分离出4株SVV,分别命名为SVV CH-01-2015、SVVCH-02-2015、SVV CH-03-2015、SVV CH-04-2015。并对4株SVV中国分离株进行全基因组序列测定。根据发表在GenBank SVV保守序列3C基因,设计特异性引物和探针;构建含3C基因序列的重组质粒作为阳性标准品,建立针对SVV检测的TaqManReal-Time PCR检测方法。将SVV细胞分离株攻毒4日龄健康仔猪,观察临床症状、病理变化,检测感染动物组织器官中的病毒载量。病毒分离鉴定结果表明:病毒分离液在第一代24h后即可产生CPE,随着传代次数的增加,出现CPE的时间缩短,细胞病变程度亦随之加剧,且可在PK-15细胞上稳定增殖。全基因组序列比对结果表明,SVV CH-01-2015与SVV CH-02-2015、CH-03-2015、SVV CH-04-2015的相似性为97.6%;SVV CH-02-2015与SVV CH-03-2015、SVV CH-04-2015的相似性为99.9%;SVV CH-03-2015与SVV CH-04-2015的相似性为100%。4株SVV中国分离株与2008年美国分离株SVV-001相比,相似性为94.3%-94.4%之间;SVV CH-01-2015与2015年美国新分离株USA/IA46008/2015和USA/IA40380/2015相似性均为96.8%;SVV CH-02-2015、SVV CH-03-2015、SVV CH-04-2015与2015年美国新分离株USA/IA46008/2015和USA/IA40380/2015相似性均为98.0%;SVV CH-01-2015与2015年巴西新分离株SVV/BRA/GO3/2015、SVV/BRA/MG1/2015、SVV/BRA/MG2/2015相似性均为97.1%;SVV CH-02-2015、SVV CH-03-2015、SVV CH-04-2015与2015年巴西新分离株SVV/BRA/GO3/2015、SVV/BRA/MG1/2015、SVV/BRA/MG2/2015相似性均为98.2%;SVV CH-01-2015与SVV CH-03-2015、SVV CH-04-2015与加拿大株11-55910-3相似性均为96.7%;SVV CH-02-2015与加拿大株11-55910-3相似性均为96.6%。4株SVV中国分离株均位于Senecavirus病毒属,与Senecavirus病毒属毒株同源性最高,由此可以确定所分离到的4株均属于Senecavirus病毒属。TaqMan Real-Time PCR检测方法的结果显示,TaqMan Real-Time PCR用标准品所构建的标准曲线相关系数(R2)达到0.999以上;可以检测到标准品下限浓度为1×102copies/μL;只以SVV的cDNA为模板的反应呈现阳性荧光信号,而以其它病毒的cDNA/DNA为模板所进行的Real-Time PCR均未检测到阳性荧光信号;组内与组间试验的变异系数均在0.96以下。本研究建立的TaqMan Real-Time PCR方法灵敏度高,特异性强,重复性好。TaqMan Real-Time PCR检测方法的成功建立,为SVV的定性检测和定量分析提供了有效的技术平台。动物致病性试验结果表明:(1)运用人工感染方式成功在4日龄仔猪身上发现临床症状和病理变化,证明SVV对仔猪具有致病性。(2)通过同居感染处理证明SVV可能是一种接触传染病且传播速度较快。(3)SVV可在4日龄仔猪内体成功复制且病毒可能在肺、脾、扁桃体、脑部和心脏中成功复制。
【关键词】：Seneca Valleyvirus 序列分析 TaqMan荧光定量PCR 致病性
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-12
• 1 前言12-17
• 1.1 概况12
• 1.2 病毒的形态12
• 1.3 病毒的基因组结构及功能12-15
• 1.4 SVV的发病情况15-16
• 1.5 诊断方法16
• 1.6 本研究的目的和意义16-17
• 2 Seneca Valleyvirus的分离和全基因组序列测定与分析17-35
• 2.1 材料与方法17-26
• 2.1.1 样品17
• 2.1.2 细胞17
• 2.1.3 基因工程菌17
• 2.1.4 细胞培养与病毒分离培养相关试剂17
• 2.1.5 分子克隆相试剂与试剂盒17-18
• 2.1.6 主要仪器设备18-19
• 2.1.7 SVV临床样品的检测19-20
• 2.1.8 SVV的分离鉴定20-21
• 2.1.9 SVV株的全基因序列测定与分析21-25
• 2.1.10 SVV的纯化25-26
• 2.1.11 SVV形态的电镜观察26
• 2.2 结果与分析26-32
• 2.2.1 SVV感染样品的鉴定结果26-27
• 2.2.2 SVV的分离鉴定结果27-28
• 2.2.3 四株SVV全基因序列测定与分析结果28-32
• 2.2.4 SVV的纯化结果32
• 2.2.5 SVV的电镜观察结果32
• 2.3 讨论32-34
• 2.3.1 用RT-PCR技术检测SVV在PK-15 细胞上稳定传代32-33
• 2.3.2 SVV分离株基因序列分析33-34
• 2.4 结论34-35
• 3 Seneca Valleyvirus Taq Man荧光定量PCR检测方法的建立35-45
• 3.1 材料与方法35-36
• 3.1.1 病毒、菌种和质粒35
• 3.1.2 主要仪器35-36
• 3.1.3 主要药品及试剂36
• 3.2 方法36-40
• 3.2.1 标准阳性模板的制备36-39
• 3.2.2 荧光定量PCR方法的建立39
• 3.2.3 Taq Man Real-Time PCR 条件最优化39
• 3.2.4 Taq Man Real-Time PCR 标准曲线的制作39
• 3.2.5 Taq Man Real-Time PCR 的敏感性试验39
• 3.2.6 Taq Man Real-Time PCR 的特异性试验39
• 3.2.7 Taq Man Real-Time PCR 的重复性试验39-40
• 3.3 结结果40-43
• 3.3.1 质粒标准品的制备40
• 3.3.2 Taq Man Real-Time PCR条件最优化40
• 3.3.3 Taq Man Real-Time PCR标准曲线的制作40-41
• 3.3.4 Taq Man Real-Time PCR敏感性试验41-42
• 3.3.5 Taq Man Real-Time PCR的特异性试验42
• 3.3.6 Taq Man Real-Time PCR的重复性试验42-43
• 3.4 讨论43-44
• 3.5 结论44-45
• 4 Seneca Valleyvirus细胞分离毒株对仔猪致病性研究45-57
• 4.1 材料与方法45-48
• 4.1.1 病毒、菌种和质粒45
• 4.1.2 主要仪器45-46
• 4.1.3 主要药品及试剂46
• 4.1.4 SVV细胞分离毒株TCID50的测定46-47
• 4.1.5 四日龄仔猪攻毒试验47
• 4.1.6 组织器官病理组织学观察47
• 4.1.7 组织器官病毒含量的测定47-48
• 4.2 结果48-54
• 4.2.1 SVV细胞分离毒株TCID50测定结果48
• 4.2.2 猪肛拭子和鼻拭子病毒检测结果48
• 4.2.3 临床症状和剖检病变观察48-50
• 4.2.4 组织器官组织病理学观察结果50-53
• 4.2.5 组织器官中病毒含量测定结果53-54
• 4.3 讨论54-56
• 4.4 结论56-57
• 全文总结57-58
• 致谢58-59
• 参考文献59-61
• 附录：硕士期间论文发表情况61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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3 杨永娟;郝春生;李懿;宋冬梅;刘宇;马淑花;田龙;李秀玲;;柯萨奇病毒A组16型VP1蛋白的原核表达及其免疫原性[J];中国生物制品学杂志;2013年01期

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本文编号：1063562