miR-142-3p通过调控靶基因PTPN11影响乳腺上皮细胞MCF-10A的增殖

发布时间：2017-10-20 13:43

  本文关键词：miR-142-3p通过调控靶基因PTPN11影响乳腺上皮细胞MCF-10A的增殖

  更多相关文章： 乳腺上皮细胞MCF-10A mi R-142-3p 靶基因 增殖

【摘要】：mi RNA是一类非编码的长度在21-24nt RNA,在翻译水平上调节基因的表达,其作用遍及整个生命过程,有研究显示,预计大于1/3的人类基因都是mi RNA的靶基因。mi RNA在对细胞的代谢与增殖、凋亡、以及肿瘤的发生发展等生理和病理过程得到了广泛的研究。mi RNA正确表达是乳腺发育与泌乳的重要保证,已有研究表明mi R-142-3p在乳腺中有抑制增殖作用,但其如何通过靶位点调控乳腺增殖等机制尚不清楚。本研究以乳腺上皮细胞MCF-10A为实验模型,结合本教研室RAN免疫共沉淀实验结果,应用mi R-142-3p超表达子和抑制子,研究mi R-142-3p在乳腺上皮细胞中对调控靶点PTPN11的作用及对乳腺上皮细胞的增殖的影响。应用活细胞RNA纳米检测技术、荧光定量PCR、Wester n blotting技术、免疫荧光技术、验证了mi R-142-3p对基因PTPN11的调控作用。应用Wester n blotting技术检测mi R-142-3p对PTP N11介导的增殖相关通路基因蛋白表达的影响,采用EDU荧光标记技术探究mi R-142-3p对细胞的增殖的影响,初步探究mi R-142-3p在乳腺上皮细胞中对增殖作用的机制。结果:(1)在乳腺上皮细胞中过表达/沉默基因mi R-142-3p后,应用活细胞RNA纳米检测技术检测mi R-142-3p表达,q RT-PCR检测PTPN11m RNA基因的表达量,同时应用Western blotting技术及免疫荧光技术检测PTPN11编码的S HP2蛋白表达变化,结果表明:mi R-142-3p负向调控PTPN11m RNA及SHP2蛋白的表达,分别从基因表达水平,蛋白表达水平证明了mi R-142-3p调控PTPN11的表达。(2)采用PTPN11 si RNA干扰技术,将干扰片段转染MCF-10A细胞,继而应用q RT-PCR技术检测PTPN11m RNA的表达变化,Western blotting技术检测PTPN11蛋白表达量的变化,结果表明mi R-142-3p超表达后对PTPN11表达的改变同PTPN11基因干扰后的结果趋势一致。(3)MCF-10A细胞中过表达mi R-142-3p后,应用Western blotting技术检测PI3K-AKT、RAS-ERK-MEK通路蛋白变化,发现PI 3K、AKT、Raf-B、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK蛋白表达量下调,过表达组mi R-142-3p表达量显著低于对照组(P0.05),在MCF-10A细胞中沉默mi R-142-3p得到相反的实验结果。应用EDU检测试剂盒检测mi R-142-3p对乳腺上皮细胞增殖的影响,发现mi R-142-3p抑制乳腺上皮细胞MCF-10A的增殖。结论:mi R-142-3p在乳腺上皮细胞中通过调控靶基因PTPN11调控PI3K/AKT、RAS-ERK-MEK的变化继而抑制乳腺上皮细胞的增殖能力。
【关键词】：乳腺上皮细胞MCF-10A mi R-142-3p 靶基因 增殖
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.2
【目录】：

• 摘要8-9
• 英文摘要9-11
• 1 前言11-19
• 1.1 miRNAs的研究进展11-13
• 1.1.1 miRNA的发现及命名11
• 1.1.2 miRNA的生物合成过程11-12
• 1.1.3 miRNA的生物学特征及功能12
• 1.1.4 miRNA的检测技术12-13
• 1.2 miRNA的靶基因的寻找及验证13-15
• 1.2.1 miRNA的靶基因的生物信息学预测13-14
• 1.2.2 靶基因的验证14-15
• 1.3 miR142 3p研究进展15
• 1.4 基因PTPN11的研究进展15-17
• 1.5 miRNA对肿瘤的调控17-18
• 1.6 研究的目的及意义18-19
• 2 材料与方法19-30
• 2.1 实验材料19
• 2.2 实验仪器19-20
• 2.3 实验试剂20
• 2.4 试剂配制20-21
• 2.5 实验方法与步骤21-30
• 2.5.1 miR1423p靶基因的筛选21-22
• 2.5.2 乳腺上皮细胞的培养22
• 2.5.3 过表达miR1423p对乳腺上皮细胞MCF-10A的影响22-27
• 2.5.4 抑制miR1423p对乳腺上皮细胞的作用27-28
• 2.5.5 过表达miR1423p在PTP N11沉寂后对乳腺上皮细胞MCF-10A的影响28-29
• 2.5.6 数据处理29-30
• 3 结果30-43
• 3.1 靶基因的筛选30-32
• 3.1.1 RNA- 蛋白免疫共沉淀结果分析30-32
• 3.1.2 miR1423p与PTP N11的作用位点32
• 3.2 miR142 3p基因过表达对乳腺上皮细胞MCF-10A的影响32-36
• 3.2.1 活细胞RNA纳米检测技术检测miR1423p表达32-33
• 3.2.2 miR1423p mimics对乳腺上皮细胞PTP N11基因表达的影响33-34
• 3.2.3 miR1423p mimics对乳腺上皮细胞PTP N11基因及增殖的相关通路蛋白的影响34-35
• 3.2.4 免疫组化35
• 3.2.5 miR1423p mim ics对乳腺上皮细胞增殖能力的影响35-36
• 3.3 miR142 3p基因沉寂对乳腺上皮细胞MCF-10A的影响36-40
• 3.3.1 活细胞RNA纳米检测技术检测miR1423p沉寂后miR1423p表达36-37
• 3.3.2 miR1423p inhibitor对乳腺上皮细胞PTP N11基因表达的影响37-38
• 3.3.3 miR-142-3pinhibitor对乳腺上皮细胞PTPN11基因及增殖的相关通路蛋白的影响38-39
• 3.3.4 免疫组化39
• 3.3.5 miR-142-3pinhibitor对乳腺上皮细胞增殖能力的影响39-40
• 3.4 PTPN11沉寂后对乳腺上皮细胞的影响40-43
• 3.4.1 PTPN11干扰片段的选择40-41
• 3.4.2 荧光定量P CR检测PTP N11 mRNA表达41-42
• 3.4.3 检验PTPN11基因抑制后蛋白的表达变化42-43
• 4 讨论43-46
• 4.1 miR142 3p检测及靶基因筛选及验证43-44
• 4.1.1 miR1423p靶基因的筛选43
• 4.1.2 miR1423p基因的检测43-44
• 4.2 miR142 3p对乳腺上皮细胞增殖及相关信号通路蛋白的影响44-46
• 5 结论46-47
• 致谢47-48
• 参考文献48-54
• 附录54-55
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文55

，

本文编号：1067481