兔出血症病毒样颗粒疫苗的研制和双抗夹心ELISA方法的建立

发布时间：2017-10-21 17:19

  本文关键词：兔出血症病毒样颗粒疫苗的研制和双抗夹心ELISA方法的建立

  更多相关文章： RHDV 原核表达 病毒样颗粒 VP60蛋白 单克隆抗体 双抗夹心ELISA

【摘要】：兔出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease virus,RHDV)的感染主要引起成年兔发生病毒性出血症(Rabbit Hemorrhagic Disease,RHD),其致死率约70-100%。RHDV感染呈世界性分布,是影响和危害养兔业发展的最主要病原。疫苗接种在治疗和预防RHD疾病传播中发挥了至关重要的作用。尽管近年来亚单位疫苗的研制取得了快速的发展,但由于抗原制备成本高以及表达量低等特点,目前商业疫苗仍然主要是组织灭活疫苗。本研究根据RHDV结构蛋白VP60具有自我组装形成病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)的特点,利用含SUMO蛋白标签的原核表达技术,首次利用大肠杆菌表达的重组VP60蛋白在体外制备了VLPs,进一步制备RHDV VLPs疫苗。同时,利用VLPs作为免疫原接种小鼠,获得7株抗VP60蛋白单克隆抗体(Monoclonal antibody,Mab),进而利用单克隆抗体建立了一种快速、操作简便、特异性强的用于检测RHDV的双抗夹心(double antibody-sandwich,DAS)ELISA方法。首先,我们将RHDV VP60基因克隆并插入原核表达载体pSMK中,获得重组质粒pSMK-VP60,将重组质粒转化到BL21-condon Plus(DE3)-RIL表达感受态细胞中,通过SDS-PAGE分析,重组蛋白在大肠杆菌中部分以可溶性表达,大小约为85kDa。利用镍柱亲和层析方法获得高纯度的重组蛋白His-SUMO-VP60蛋白。Western blot方法显示该重组蛋白可以被兔抗VP60多克隆抗血清识别。重组VP60蛋白的表达为下一步研究体外制备VLPs提供了物质基础。利用特异性SUMO蛋白酶对重组蛋白进行酶切和纯化,通过电子投射显微镜观察VP60蛋白能够自我组装形成直径约为25~30nm大小的VLPs,其形态结构类似于亲本RHDV粒子。Western blot方法结果显示该VLPs可以被兔抗VP60多克隆抗血清识别,表明体外制备VLPs具有和VP60蛋白相似的抗原性;分别将组织灭活疫苗、His-SUMO-VP60、VLPs和PBS免疫实验兔。以间接ELISA方法检测结果显示VLPs免疫兔后抗体消长规律同灭活疫苗相类似,抗体呈上升趋势。同时淋巴细胞增殖以及细胞因子IL-4和IFN-γ的水平都明显高于PBS对照组。以上结果表明RHDV VLPs具有刺激兔体液免疫和细胞免疫的能力,具有作为RHD疫苗的潜力。由于RHDV VLPs展现出良好的免疫原性,我们利用VLPs作为免疫原制备了抗VP60单克隆抗体。首先,将VLPs免疫小鼠,加强免疫后将小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行了融合。以兔RHDV阳性肝脏研磨液作为检测抗原,利用间接ELISA方法筛选获得7株能稳定分泌抗VP60单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为4A1,5B2,6F6,9H9,11D4,15C3,16F2。Western blot结果表明7株抗VP60 Mabs都可与His-SUMO-VP60蛋白反应;IFA结果表明7株Mabs都可以与真核重组表达质粒pSCA1/VP60在BHK-21细胞中表达的重组蛋白反应。通过抗体配对实验,确定以9H9为捕获抗体,辣根过氧化物酶标记(HRP)的9H9为检测抗体建立双抗夹心ELISA方法。利用单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体,提高了检测方法的特异性,该双抗夹心ELISA方法对12个RHDV阳性样品检测率为100%。利用RT-PCR方法和双抗夹心ELISA方法对85份兔肝脏样品进行检测,总符合率为98.8%,表明该双抗夹心ELISA方法具有高敏感型和特异性,可以用于RHD的临床检测。该方法对于临床诊断RHDV感染提供了有效的检测方法。
【关键词】：RHDV 原核表达 病毒样颗粒 VP60蛋白 单克隆抗体 双抗夹心ELISA
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-15
• 第一章 引言15-23
• 1.1 兔出血症和兔出血症病毒概述15
• 1.2 病毒样颗粒疫苗概述15-19
• 1.2.1 常用表达系统16-17
• 1.2.2 病毒样颗粒的应用进展17-19
• 1.2.3 存在问题及应用前景19
• 1.3 兔出血症疫苗研究现状19-21
• 1.3.1 灭活疫苗19
• 1.3.2 亚单位疫苗19-21
• 1.4 兔出血症诊断方法的研究现状21-22
• 1.5 基于单克隆抗体的双抗夹心ELISA诊断方法22
• 1.6 本研究的目的及意义22-23
• 第二章 兔出血症病毒VP60蛋白的表达和鉴定23-31
• 2.1 材料23-24
• 2.1.1 质粒、菌株和抗体23
• 2.1.2 主要实验试剂23-24
• 2.1.3 主要仪器24
• 2.2 实验方法24-27
• 2.2.1 VP60基因的扩增24
• 2.2.2 pSMK-VP60原核表达重组质粒的构建和鉴定24-26
• 2.2.3 重组VP60蛋白的表达和纯化26-27
• 2.2.4 重组VP60蛋白的纯化27
• 2.2.5 SDS-PAGE和Western blotting检测27
• 2.3 结果27-30
• 2.3.1 VP60基因的扩增27-28
• 2.3.2 重组质粒pSMK-VP60在DH5α 中的PCR鉴定28-29
• 2.3.3 重组VP60蛋白的表达29
• 2.3.4 重组VP60蛋白的反应原性鉴定29
• 2.3.5 重组VP60蛋白的可溶性分析及纯化29-30
• 2.4 讨论30-31
• 第三章 VP60蛋白VLPs的制备和免疫学性检测31-39
• 3.1 材料与方法31-32
• 3.1.1 试验动物，灭活疫苗，兔抗RHDV阳性血清、阴性血清31
• 3.1.2 主要实验试剂31
• 3.1.3 主要仪器31-32
• 3.2 实验方法32-34
• 3.2.1 VLPs的制备32
• 3.2.2 重组VP60蛋白的酶切效果与VLPs形成的鉴定32
• 3.2.3 SPF兔免疫试验和攻毒保护实验32-34
• 3.3 结果34-37
• 3.3.1 体外制备VLPs的鉴定结果34-35
• 3.3.2 VP60特异性抗体水平的检测35-36
• 3.3.3 淋巴细胞增殖试验检测36
• 3.3.4 白介素-4 细胞因子检测36-37
• 3.3.5 干扰素-γ 水平的检测37
• 3.3.6 动物保护试验37
• 3.4 讨论37-39
• 第四章 RHDV VP60蛋白单克隆抗体的制备与鉴定39-44
• 4.1 材料与方法39
• 4.1.1 细胞和实验动物39
• 4.1.2 主要试剂39
• 4.2 实验方法39-41
• 4.2.1 动物免疫39
• 4.2.2 间接ELISA方法检测小鼠血清中抗VP60蛋白效价39-40
• 4.2.3 细胞融合40
• 4.2.4 有限稀释、克隆阳性杂交瘤细胞40
• 4.2.5 腹水的制备40
• 4.2.6 单克隆抗体亚型的测定40-41
• 4.2.7 Western blotting分析单克隆抗体生物学特性41
• 4.2.8 间接免疫荧光分析单克隆抗体生物学特性41
• 4.3 结果41-43
• 4.3.1 融合前小鼠血清抗VP60蛋白抗体效价测定41
• 4.3.2 阳性杂交瘤细胞的筛选41-42
• 4.3.3 单克隆抗体亚型的鉴定42
• 4.3.4 Western blotting方法鉴定单克隆抗体与VP60蛋白的互相作用42-43
• 4.3.5 间接免疫荧光方法鉴定单克隆抗体与VP60蛋白的互相作用43
• 4.4 讨论43-44
• 第五章 双抗夹心ELISA检测RHDV方法的初步的建立44-52
• 5.1 材料和方法44-46
• 5.1.1 抗体及样品44
• 5.1.2 试剂44-45
• 5.1.3 样品的处理45
• 5.1.4 抗体配对实验45
• 5.1.5 确定捕获抗体和检测抗体最佳工作浓度45
• 5.1.6 确定最适包被条件45
• 5.1.7 确定最佳封闭剂45
• 5.1.8 确定最佳封闭条件45-46
• 5.1.9 确定最佳酶标抗体稀释液46
• 5.1.10 确定阴阳性标准46
• 5.1.11 特异性试验46
• 5.1.12 临床样品检测试验46
• 5.2 结果46-50
• 5.2.1 抗体配对试验46
• 5.2.2 双抗夹心ELISA法的建立46-48
• 5.2.3 最适包被条件的确定48
• 5.2.4 最适封闭剂的确定48
• 5.2.5 最适封闭条件的确定48
• 5.2.6 最适酶标抗体稀释液的确定48-49
• 5.2.7 临界值的确定49
• 5.2.8 试验的特异性49-50
• 5.2.9 临床样品检测结果分析50
• 5.3 讨论50-52
• 第六章 全文结论52-53
• 参考文献53-60
• 致谢60-61
• 作者简介61

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 程晋霞;曾静;张蕾;张琳;张海予;刘雪松;曹栋;;霍乱弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的建立[J];细胞与分子免疫学杂志;2013年11期

2 李超美;王芳;蔡少平;任雪枫;胡波;范志宇;徐为中;何孔旺;;检测兔出血症病毒抗体间接ELISA方法的建立[J];江苏农业学报;2010年03期

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本文编号：1074473