猪链球菌的分离鉴定及1910RR蛋白多克隆抗血清的制备

发布时间：2017-10-23 05:05

  本文关键词：猪链球菌的分离鉴定及1910RR蛋白多克隆抗血清的制备

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【摘要】：猪链球菌是一种重要的病原菌,对人和兽都具有致病性,猪感染链球菌会出现脑膜炎,败血症,心内膜炎,关节炎等,人感染链球菌会出现胸膜炎,败血症,甚至会死亡,不但导致了养殖业巨大的经济损失,并引起了很大的公共健康问题。猪链球菌的血清型按照荚膜多糖抗原的差别可以分为35个。致病性血清型有1型,1/2型,2型,7型,9型和14型,其中2型菌株的致病性最强,流行最为广泛,所以被认为是研究链球菌的代表。为了鉴定导致湖北省地区某养猪场猪只急性死亡的致病菌,并控制该猪场病情,试验采用PCR方法对菌株进行鉴定与分型,再对分离菌进行药敏试验和致病性试验。由于鉴定出来的菌株并非2型,不适合作为研究所用的代表菌株,所以只好引入标准2型菌株,并对其一对双组份调控系统1910HK/RR中的1910RR蛋白做了相关研究。所做工作报道如下：(1)猪链球菌的临床分离和耐药性试验采取患病猪的心包积液和肺组织各3份被采集作为病理材料,在5%血清的胰蛋白大豆琼脂培养基上划线接种,进行菌落形态和革兰氏染色的观察。采用猪链球菌通用引物鉴定其为猪链球菌,再采用型特异性引物来确定它的血清型。为了确定有效的药物进行治疗对其进行了药敏实验,为了检验其致病性对小鼠进行攻毒试验。试验结果表明：该病原菌为猪链球菌,但是血清型为除1型,2型,7型,9型以外的其他型。头孢菌素、青霉素、氨卞西林、氯霉素、利福平、万古霉素、阿莫西林、氧氟沙星、左氧氟沙星等高度抑制该菌的生长,环丙沙星,恩诺沙星、复方新诺明、四环素中度抑制该菌的生长,而多黏霉素B、磺胺甲基异恶唑、林可霉素等没有抑制效果。同时该菌的致病性较强,可导致小鼠死亡。这说明该猪场致病菌为猪链球菌,且可使用头孢菌素和青霉素等药物进行治疗。(2)1910RR蛋白多克隆抗体的制备PCR扩增的1910rr基因与表达质粒pET30aBamHI/HindIII双酶切后,以T4连接酶连接,构建表达载体pET30a-1910rr,酶切和测序鉴定正确后,运用化学转化法将其导入大肠杆菌BL21进行表达。通过改变诱导时间和IPTG浓度,降低诱导的温度,确定了pET30a-1910RR融合蛋白表达的最佳条件。以六联组氨酸镍柱吸附融合蛋白,用不同浓度的咪唑进行洗脱,以此确定蛋白洗脱的最佳咪唑浓度。洗脱下的蛋白采用TE透析液透析,除去咪唑等小分子杂质后得到较纯的蛋白。测量蛋白质浓度,再用蔗糖隔着透析袋吸附其中的水分以提高浓度。纯化后的1910RR蛋白对日本大耳兔进行皮下免疫,2周一次,共免疫四次,第三次和第四次免疫时剂量增加。三次免疫后用Western blot检测1910RR蛋白的免疫学活性,四免后以琼脂扩散实验测定所制备的1910RR多克隆抗体效价。结果表明：构建的质粒pET30a-1910rr酶切与测序鉴定正确。融合蛋白成功的在上清中表达,纯化效果较好。免疫印迹检测证实了血清中1910RR蛋白多克隆抗体的存在。琼脂扩散实验测定了所制备的1910RR蛋白多克隆抗体的效价。本研究从送检的病死猪的心包积液、肺等病理材料中成功分离到致病性猪链球菌,确定了病因,而对分离菌进行的药敏试验确定了治疗药物,对控制该猪场病情做出了贡献；同时通过原核表达系统表达了猪链球菌2型反应调控蛋白1910RR,制备了兔抗1910RR蛋白多克隆抗体,为运用CHIP-Seq技术研究双组分调控系统1910HK/RR与受调控基因的作用方式,并获得与1910RR蛋白相互作用的DNA序列及核心位点奠定物质基础。
【关键词】：猪链球菌 分离鉴定 药敏试验 1910RR蛋白 多克隆抗体
【学位授予单位】：长江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.611
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-8
• 英文缩写词表8-10
• 第一章 文献综述10-23
• 1.1 猪链球菌的病原学与流行病学10
• 1.2 临床症状与病理变化10-11
• 1.3 细菌鉴定11-15
• 1.4 猪链球菌致病机制研究进展15-20
• 1.5 耐药机制研究进展20-21
• 1.6 猪链球菌疫苗研究进展21-22
• 1.7 研究的目的与意义22-23
• 第二章 猪链球菌的分离鉴定与药敏试验23-31
• 2.1 材料与方法23-25
• 2.2 结果25-29
• 2.3 小结与讨论29-31
• 第三章 猪链球菌1910RR蛋白多克隆抗体的制备31-45
• 3.1 材料与方法31-39
• 3.2 结果与分析39-44
• 3.3 小结与讨论44-45
• 第四章 讨论与结论45-47
• 4.1 讨论45-46
• 4.2 结论46-47
• 致谢47-48
• 参考文献48-57
• 个人简介57-58

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1 朱凤才,杨华富,胡晓抒,汪华,王广和,宋亚军,杨瑞馥;人源和猪源猪链球菌的同源性研究[J];中华流行病学杂志;2000年06期

2 唐文渊 ,Zygmunt Pejsak;猪链球菌是一种条件性病原菌[J];国外畜牧学(猪与禽);2005年04期

3 查红波;2型猪链球菌研究进展[J];江西饲料;2005年04期

4 许青华;重新认识猪链球菌[J];畜牧兽医科技信息;2005年09期

5 刘华;喻华;周忠华;颜英俊;黄文方;;致生猪疫情的猪链球菌检测结果分析[J];中华检验医学杂志;2006年01期

6 崔正瀛;李学瑞;柳纪省;;2型猪链球菌的分子生物学研究进展[J];中国畜牧兽医文摘;2006年03期

7 白昀;覃伦;龙剑明;熊毅;覃芳芸;朱伟;郭建刚;李华明;刘棋;;猪链球菌9型的分离与鉴定[J];上海畜牧兽医通讯;2007年01期

8 王福贵;龙忠臣;王海鹏;;临床分离猪链球菌的药物敏感性分析[J];黑龙江畜牧兽医;2007年06期

9 覃芳芸;陈磊;潘杰;熊毅;白昀;朱伟;郭建刚;李华明;刘棋;;猪链球菌1型的分离与鉴定[J];黑龙江畜牧兽医;2007年09期

10 鲁杏华;谈志祥;何世成;刘道新;邱立新;范仲鑫;唐小明;郑姣妹;;猪链球菌2型湖南株的分离与鉴定[J];中国兽医杂志;2008年10期

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1 聂小想;崔言顺;沈志强;管宇;逄媛;刘吉山;王艳;;20株猪链球菌核糖体基因多态性的研究[A];首届中国兽药大会——兽医生物制品学、兽医微生物学学术论坛论文集（2008）[C];2008年

2 刘梅芬;吴志明;闫若潜;盛敏;赵明军;拜廷阳;;猪链球菌种与9型猪链球菌二重PCR检测方法的建立及应用[A];中国畜牧兽医学会小动物医学分会第四次学术研讨会、中国畜牧兽医学会兽医外科学分会第十六次学术研讨会论文集（2）[C];2009年

3 刘梅芬;吴志明;闫若潜;盛敏;赵明军;拜廷阳;;猪链球菌种与9型猪链球菌二重PCR检测方法的建立及应用[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集（下册）[C];2009年

4 张安定;朱伟峰;胡攀;金梅林;;猪链球菌分子流行病学研究[A];第三届全国微生物资源学术暨国家微生物资源平台运行服务研讨会会议论文摘要集[C];2011年

5 何孔旺;倪艳秀;王继春;何家惠;王伟峰;杨瑛;陆承平;林继煌;;猪链球菌2型的分子流行病学研究[A];猪的重要传染病防治研究新成果——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第五届理事会第二次全体会议暨防检疫专业委员会第7次学术交流会论文集[C];2002年

6 徐建国;郑翰;叶长芸;景怀琦;;猪链球菌的二阶段致病机理假说[A];第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2008年

7 熊毅;刘棋;覃芳芸;朱伟;徐贤坤;付薇;;广西猪链球菌2型流行病学研究[A];第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2008年

8 臧莹安;谢乐新;李家侨;庞木生;李淼;宋帅;李春玲;;表观健康的猪肉携带猪链球菌的调查[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年

9 罗玲;徐涤平;刘泽文;郑浩;汪宏才;;猪链球菌2型的研究进展[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第六届全国会员代表大会暨第11次学术研讨会论文集[C];2005年

10 刘春生;徐耀辉;陈陆;杨霞;王新娟;高冬生;王永生;程海卫;刘春明;王川庆;;猪链球菌种及1、2、7型多重PCR检测方法的建立及应用[A];中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会论文集[C];2010年

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1 记者 曾星;快速猪链球菌检测方法问世[N];中国国门时报;2005年

2 记者 姚雷 张颖;猪链球菌检测将有据可依[N];中国国门时报;2005年

3 雒庆举;可能对“猪链球菌”设险吗[N];中国保险报;2005年

4 井 韦;把四天缩短为四小时[N];中国质量报;2005年

5 菊　文;积极应对猪链球菌2型疫情[N];中国国门时报;2005年

6 记者 何成军 见习记者 钱河山;猪链球菌疫情不足忧[N];甘肃经济日报;2005年

7 郑灵巧;猪链球菌进犯人类告诉我们什么[N];健康报;2005年

8 北京地坛医院主任医师 蔡皓东;猪链球菌又到人间作孽[N];健康报;2005年

9 记者 原国锋;猪链球菌快速检测方法通过鉴定[N];人民日报;2005年

10 逸闻;猪链球菌序列变异导致毒力增加[N];中国畜牧兽医报;2006年

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1 姚新月;2型猪链球菌无毒株的分离鉴定与比较基因组学研究[D];第三军医大学;2015年

2 潘子豪;致仔猪脑膜炎新型猪链球菌的鉴定[D];南京农业大学;2014年

3 方丽华;猪链球菌2型超氧化物歧化酶SodA与丝氨酸/苏氨酸去磷酸酶Stp1影响细菌毒力研究[D];浙江大学;2016年

4 杜斌;猪链球菌2型环二腺苷酸（c-di-AMP）代谢相关基因的生物学功能研究[D];上海交通大学;2015年

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8 李学瑞;猪链球菌防治新技术研究[D];中国农业科学院;2011年

9 吴全忠;猪链球菌2型在模型动物豚鼠体内的动态分布及基因免疫[D];南京农业大学;2001年

10 欧瑜;猪链球菌2型毒力相关蛋白的检测及其基因片段的克隆与表达[D];南京农业大学;2001年

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1 李晓云;东北地区猪链球菌对大环内酯类抗生素耐药机制研究[D];东北农业大学;2009年

2 赵焕灿;浙江省猪链球菌血清及分子流行病学调查[D];浙江大学;2010年

3 张静;猪链球菌二氢硫辛酰胺脱氢酶的生物学功能初探及串联蛋白的免疫保护评价[D];上海交通大学;2012年

4 岳修伟;上海部分地区猪链球菌2型流行病学调查及其耐药性研究[D];上海交通大学;2013年

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7 王丹;六种虫媒病毒及猪链球菌2型检测蛋白芯片的研制及应用[D];华中农业大学;2011年

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9 孙亮;猪链球菌2型噬菌体裂解酶LyACCG的关键结构域及关键氨基酸位点鉴定[D];甘肃农业大学;2016年

10 杨宝玲;2型猪链球菌SSU05-0474蛋白的单克隆抗体制备及抗原表位鉴定[D];沈阳农业大学;2016年

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