饲用乳酸菌的筛选及其抑菌功能物质的初步研究

发布时间：2017-10-23 09:32

  本文关键词：饲用乳酸菌的筛选及其抑菌功能物质的初步研究

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【摘要】：饲料在运输、储存过程中容易携带大肠杆菌、沙门氏菌,单增李斯特菌等病原微生物,这些病原微生物随着饲料进入动物体内,会引起动物肠道传染病,对动物的健康构成严重威胁。解决这一问题目前使用最广泛的仍然是抗生素。然而随着抗生素的应用,细菌耐药性日益普遍,同时,抗生素的药物残留问题也逐渐引起了人们的注意。世界许多畜牧发达国家和地区限制抗生素的使用,研究和开发绿色饲料添加剂产品,已经成为世界性的研究课题。筛选获得具有抑菌功能的,耐酸耐胆盐和耐饲料加工的饲用乳酸菌,并确定它的抑菌功能物质对开发绿色饲料添加剂具有重要的实用价值。从饲料原料中分离得到能够抑制大肠杆菌生长的乳酸菌,排除发酵液中有机酸和H2O2的干扰,初步确定4株具有较强抑菌活性的饲用乳酸菌。进一步通过耐酸、耐胆盐和耐热实验将乳酸菌R16确定为目标菌,经形态学、API和16S rDNA基因序列分析鉴定该菌株为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici),并将其命名为乳酸片球菌R16(Pediococcus acidilactici R16)。通过超滤、阴离子交换色谱、凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱(reversed-phase high performance liquid,RP-HPLC)从乳酸片球菌R16发酵液中分离抑制大肠杆菌的活性物质,获得一种对大肠杆菌具有抑制作用的乳酸菌素,通过液相色谱-质谱联用技术(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)初步鉴定该乳酸菌素的分子量大小为705.63Da,等电点为3.58,氨基酸序列为ENGEEE。通过化学合成的方法,确认该乳酸菌素对大肠杆菌具有抑制作用,将其命名为乳酸菌素R16。对乳酸菌素R16进行生物学特性研究,发现其在pH 3.0~5.0时,抑菌效果最好,在pH 6.0~8.0时,抑菌活性逐渐降低。在≤80℃中处理30 min,乳酸菌素R16的抑菌活性几乎不变,在90、100、121℃处理30、30、15 min,其抑菌活性分别损失了21.95%、49.47%和59.98%。乳酸菌素R16对蛋白酶敏感性低,经蛋白酶处理后,其抑菌活性无明显变化。对抑菌谱的测定实验表明,乳酸菌素R16对革兰氏阳性菌具有较强的抑制作用,对革兰氏阴性菌抑制效果不明显,且对大肠杆菌和单增李斯特菌的最小抑菌浓度为6.40 mg?mL~(-1),对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为3.40 mg?mL~(-1)。乳酸片球菌R16和乳酸菌素R16能够有效抑制豆粕中大肠杆菌的增长,且能够杀死17.20%和33.44%豆粕中的大肠杆菌。乳酸菌素R16对于酿酒酵母和植物乳杆菌具有一定的增殖作用。乳酸菌素R16对过氧化氢、羟自由基、DPPH?自由基和超氧阴离子具有一定的清除能力,清除率分别为25.65%、70.13%、79.42%和10.11%。
【关键词】：乳酸片球菌 乳酸菌素 大肠杆菌 绿色饲料添加剂
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S816
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-8
• 第一章 绪论8-14
• 1.1 饲料安全8-9
• 1.1.1 病原微生物与饲料安全8
• 1.1.2 抗生素与饲料安全8
• 1.1.3 绿色饲料添加剂与饲料安全8-9
• 1.2 乳酸菌研究进展9-10
• 1.2.1 乳酸菌的定义与分类9
• 1.2.2 乳酸菌在动物养殖上的作用9-10
• 1.3 乳酸菌素研究进展10-12
• 1.3.1 乳酸菌素概述10-11
• 1.3.2 乳酸菌素的分类11
• 1.3.3 乳酸菌素的应用11-12
• 1.4 立题背景与意义12-13
• 1.5 研究内容13-14
• 第二章 材料与方法14-22
• 2.1 材料14
• 2.1.1 实验原料14
• 2.1.2 主要试剂及材料14
• 2.2 仪器设备14-15
• 2.3 产乳酸菌素乳酸菌的筛选与鉴定15-17
• 2.3.1 培养基制备15
• 2.3.2 乳酸菌的筛选15
• 2.3.3 产乳酸菌素乳酸菌的筛选15-16
• 2.3.4 产乳酸菌素乳酸菌的复筛16
• 2.3.5 产乳酸菌素且能够耐酸耐胆盐乳酸菌的筛选16
• 2.3.6 产细菌素乳酸菌的鉴定16-17
• 2.4 抑菌活性物质的分离纯化及鉴定17-18
• 2.4.1 乳酸菌素效价分析17
• 2.4.2 超滤17
• 2.4.3 阴离子交换色谱17
• 2.4.4 凝胶过滤色谱17-18
• 2.4.5 半制备RP-HPLC18
• 2.4.6 LC-MS鉴定18
• 2.4.7 合成验证18
• 2.5 抑菌活性物质的生物学特性研究18-22
• 2.5.1 pH对抑菌活性物质的影响18
• 2.5.2 温度对抑菌活性物质的影响18
• 2.5.3 酶处理对抑菌活性物质的影响18-19
• 2.5.4 抑菌活性物质的抑菌谱19
• 2.5.5 抗菌活性测定19
• 2.5.6 抑菌活性物质对益生菌的影响19
• 2.5.7 抑菌活性物质的抗氧化能力19-21
• 2.5.8 乳酸片球菌R16在豆粕中的应用21
• 2.5.9 乳酸菌素R16在豆粕中的应用21-22
• 第三章 结果与讨论22-39
• 3.1 产乳酸菌素乳酸菌的筛选与鉴定22-27
• 3.1.1 产乳酸菌素乳酸菌的筛选22
• 3.1.2 产乳酸菌素乳酸菌的复筛22-23
• 3.1.3 产乳酸菌素且能够耐酸耐胆盐耐高温乳酸菌的筛选23-24
• 3.1.4 产乳酸菌素乳酸菌的鉴定24-26
• 3.1.5 系统发育树构建26
• 3.1.6 小结26-27
• 3.2 活性物质的分离纯化及鉴定27-32
• 3.2.1 超滤27
• 3.2.2 阴离子交换色谱27-28
• 3.2.3 凝胶过滤色谱28-29
• 3.2.4 半制备RP-HPLC29-30
• 3.2.5 LC-MS30-31
• 3.2.6 合成验证31
• 3.2.7 小结31-32
• 3.3 乳酸菌素R16的生物学特性研究32-39
• 3.3.1 pH对乳酸菌素R16的影响32-33
• 3.3.2 温度对乳酸菌素R16的影响33
• 3.3.3 酶处理对乳酸菌素R16的影响33-34
• 3.3.4 乳酸菌素R16的抑菌谱34
• 3.3.5 乳酸菌素R16的最低抑菌浓度34-35
• 3.3.6 乳酸菌素R16对益生菌的影响35
• 3.3.7 乳酸菌素R16的抗氧化能力35-36
• 3.3.8 乳酸片球菌R16及乳酸菌素R16在豆粕中的应用36-37
• 3.3.9 小结37-39
• 主要结论与展望39-40
• 致谢40-41
• 参考文献41-44
• 附录: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文44

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本文编号：1082681