HSP70对热应激条件下仔猪睾丸支持细胞乳酸合成的影响

发布时间：2017-10-25 17:13

  本文关键词：HSP70对热应激条件下仔猪睾丸支持细胞乳酸合成的影响

  更多相关文章： HSP70 乳酸 睾丸支持细胞 猪 热应激

【摘要】：睾丸支持细胞(Sertoli cells,SCs)产生的乳酸,不仅作为精细胞发育的营养物质,而且在精子生成过程中起到抗凋亡作用。我们已经知道热应激对许多哺乳动物的精子生成都有负面影响,而热休克蛋白(heat shock protein,HSPs)在热应激反应中起到抗凋亡作用。但是HSPs是否通过热诱导生成的乳酸对精子生成起到间接抗凋亡作用还不清楚。本研究的目的是:(1)热应激是否引起乳酸合成量的变化;(2)参与热应激后乳酸合成的主要酶类及其表达量的变化;(3)热应激后主要表达的HSPs种类及其表达量的变化;(4)HSPs是否通过影响乳酸合成相关酶的表达调控热应激后乳酸的合成。本研究以20日龄左右的仔猪睾丸为实验材料,首先用43°C培养箱对体外培养的支持细胞进行30 min的热处理,随后放回32°C培养箱进行(0 h,12 h,24 h,36 h,48 h)热应激后恢复处理,收集培养基和细胞进行乳酸合成量的测定。接着用同样的方法处理,用PCR琼脂糖凝胶电泳检测出支持细胞乳酸合成相关的主要酶类(GLUTs/LDHs)和热应激后主要起作用的HSPs,并进一步对筛选出的GLUTs/LDHs/HSPs用荧光定量RCR和western blot测定热应激后的表达变化。然后用HSPs抑制剂和RNA干扰试剂分别处理热应激前的支持细胞,并用western blot检测HSPs的蛋白水平以筛选抑制剂,随后用筛选出的适宜浓度的抑制剂和干扰试剂再分别处理支持细胞,并检测支持细胞热应激后乳酸合成量,同时用western blot和荧光定量PCR检测乳酸合成相关酶的表达水平的变化。实验结果如下:(1)体外培养的仔猪睾丸支持细胞受到热应激(43°C培养30 min)后,乳酸产量增加,并且随着热应激后恢复时间的延长而增加,在24 h时达到最大值(P0.01)。(2)GLUT3,LDHA为仔猪睾丸支持细胞乳酸生成过程的两种主要的酶,HSP70为仔猪睾丸支持细胞热应答主要的HSPs。(3)热应激(43°C培养30 min)促进了GLUT3、LDHA的表达,mRNA水平在12 h时达最大值(P0.01),蛋白水平在24 h时达最大值(P0.01)。(4)热应激(43°C培养30 min)促进了HSP70的表达,mRNA水平在0 h达最大值(P0.01),蛋白水平在24 h时达最大值(P0.01)。(5)HSP70抑制剂(槲皮素)和HSP70的siRNA都显著抑制热应激后乳酸合成量以及GLUT3和LDHA的表达。综上所述,热应激诱导产生的HSP70通过上调SLC2A3(GLUT3)和LDHA的表达,促进了热应激后乳酸的合成。这为热应激提高生精细胞抗凋亡的调节机制提供了新的思路。
【关键词】：HSP70 乳酸 睾丸支持细胞 猪 热应激
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828
【目录】：

• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 第一章 文献综述11-23
• 1 睾丸支持细胞的功能11-13
• 1.1 支持细胞的结构和位置11-12
• 1.2 支持细胞参与形成血睾屏障12
• 1.3 支持细胞对生精细胞的支持营养作用12-13
• 2 睾丸内乳酸的作用13-14
• 2.1 睾丸内乳酸的产生13
• 2.2 乳酸的作用13-14
• 3 睾丸热应激的研究概况14-17
• 3.1 热应激概述14-15
• 3.2 热应激对睾丸各类细胞的影响15-17
• 4 HSPs与睾丸热应激17-22
• 4.1 HSPs在热应激中的主要功能17-18
• 4.2 HSPs在热应激中的表达调控机制18-19
• 4.3 几种HSPs在睾丸热应激时的作用19-22
• 5 研究展望22-23
• 第二章 引言23-25
• 第三章 实验材料与方法25-36
• 1 实验材料25-28
• 1.1 实验材料25
• 1.2 实验相关试剂25-26
• 1.3 试剂配制26-27
• 1.4 主要实验仪器27-28
• 2 实验方法28-35
• 2.1 支持细胞分离培养28-29
• 2.2 RNA干扰29
• 2.3 热处理29
• 2.4 槲皮素处理29-30
• 2.5 蛋白检测30-32
• 2.6 mRNA检测32-35
• 2.7 乳酸检测35
• 3 统计分析35-36
• 第四章 实验结果36-48
• 1 RNA完整性检测36
• 2 荧光定量扩增曲线和融解曲线分析36-37
• 3 热应激对仔猪睾丸支持细胞乳酸合成的影响37-40
• 3.1 热应激对仔猪睾丸支持细胞乳酸合成量的影响37-38
• 3.2 GLUT3和LDHA为热应激前后支持细胞主要的乳酸合成相关酶38-39
• 3.3 热应激对仔猪睾丸支持细胞SLC2A3和LDHA mRNA表达的影响39
• 3.4 热应激对仔猪睾丸支持细胞GLUT3和LDHA蛋白表达的影响39-40
• 4 热应激对仔猪睾丸支持细胞热休克蛋白的影响40-41
• 4.1 仔猪睾丸支持细胞在热应激后起主要作用的HSPs种类40
• 4.2 热应激处理对HSP70.2 mRNA表达的影响40-41
• 4.3 热应激处理对HSP70蛋白表达的影响41
• 5 槲皮素对乳酸合成的影响41-45
• 5.1 槲皮素对HSP70蛋白表达的影响41-42
• 5.2 槲皮素对乳酸合成量的影响42-43
• 5.3 槲皮素对GLUT3和LDHA蛋白表达的影响43
• 5.4 槲皮素对SLC2A3和LDHA mRNA表达的影响43-44
• 5.5 槲皮素对SLC2A3和LDHA mRNA表达的影响44-45
• 6 siRNA对睾丸支持细胞乳酸合成的影响45-48
• 6.1 si RNA对HSP70蛋白表达的影响45-46
• 6.2 si RNA对乳酸合成量的影响46
• 6.3 si RNA对GLUT3和LDHA蛋白的影响46-47
• 6.4 si RNA对支持细胞SLC3A2/LDHA mRNA的影响47-48
• 第五章 讨论48-51
• 1 热应激对睾丸支持细胞乳酸生成的影响48
• 2 乳酸合成量的增加与GLUT3和LDHA有关48-49
• 3 HSP70为仔猪睾丸支持细胞主要的热诱导HSPs49
• 4 HSP70参与热应激后乳酸合成的调节49-50
• 5 总结50-51
• 第六章 结论51-52
• 参考文献52-61
• 致谢61

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