miR-29c在鹅肥肝形成中的表达与功能研究

发布时间：2017-10-25 22:04

  本文关键词：miR-29c在鹅肥肝形成中的表达与功能研究

  更多相关文章： miR-29c 鹅肥肝 靶基因 脂肪代谢 转录因子

【摘要】：MicroRNA (miRNA)是一类长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,主要通过与靶基因的3'UTR区结合使靶基因的mRNA翻译受到抑制或直接降解,从而调控发育、代谢和癌症等生物过程,是基因表达的重要调控因子。肝脏是脂肪酸合成的主要场所,在动物的脂质代谢过程中发挥着重要的作用。有研究发现miR-29c可以调控肝脏的纤维化,并且在抑制肝癌细胞转移等方面发挥重要作用。然而,在脂肪肝形成过程中miR-29c的表达与调控以及其功能尚不清楚。本实验对此进行较深入的研究,主要结果如下：1、填肥抑制了miR-29c在肝脏、胸肌和腹脂中的表达。本研究利用实时荧光定量技术测定了填肥朗德鹅与对照朗德鹅(常规饲养)胸肌、腹脂和肝脏中的miR-29c表达水平。结果显示,填肥显著抑制了这些与脂肪代谢相关组织中的miR-29c的表达,提示其在鹅肝脏脂肪代谢过程中扮演重要角色。2、miR-29c的靶基因预测与筛选。依据鸡鹅miR-29c种子序列的保守性,参考鸡的基因组序列,利用生物信息学软件miRDB、TargetScan、和Microcosm预测miR-29c的靶基因,两两取交集并参考已有文献筛选得到COL3A1、SGK1、INSIG1、DDX3X、 PPM1D、 TNFAIP3共6个靶基因。然后,通过对预测靶基因的定量验证发现COL3A1、SGK1、INSIG1三个靶基因在填饲后朗德鹅肝脏中的表达量显著上调,DDX3X、PPM1D、TNFAIP3的表达则未出现显著上调。依据miRNA通常与其靶基因表达量相反,我们推定COL3A1、SGK1和INSIG1最有可能是miR-29c靶基因。3、miR-29c的靶基因验证。首先,设计候选靶基因3’UTR序列特异性引物进行PCR扩增,经克隆测序获得扩增产物的序列。再利用pMIR-REPORT分别构建靶基因3'UTR靶序列区的表达载体,同时依据获得的鹅miR-29c成熟序列设计其模拟物用于靶向关系的验证。最后,通过在非肝细胞系CHO中建立的双荧光素酶系统验证鹅miR-29c的三个靶基因。结果表明COL3A1、SGK1和INSIG1为鹅miR-29c的靶基因。因此,miR-29c可能通过对这些基因的作用影响鹅肥肝的形成。4、在鹅原代肝细胞中miR-29c对靶基因表达的影响。通过设置miR-29c过表达组、抑制组以及相应的对照组,经肝细胞转染实验,以及靶基因COL3A1、SGK1、INSIG1的定量检测,发现COL3A1和INSIG1的表达在鹅原代肝细胞中受到miR-29c的调控,而SGK1的表达受miR-29c的调控可能为肝细胞中的其他因子所干扰。miR-29c对COL3A1和INSIG1表达的影响更容易在miR-29c表达受到抑制时发生。5、脂肪肝形成相关因子处理鹅肝细胞对miR-29c表达的影响。本研究利用不同浓度的葡萄糖、胰岛素、脂肪酸分别处理鹅肝细胞以检测对miR-29c表达的影响,结果显示100mmol/L葡萄糖和0.5mmol/L棕榈酸钾均可显著降低miR-29c的表达,但100 nmol/L胰岛素和0.5mmol/L油酸钠对miR-29c表达的影响甚少。说明高糖、高脂均可以诱导鹅肥肝中miR-29c的表达,进一步说明miR-29c的表达受鹅脂肪肝形成相关因子的调控。6、miR-29c介导葡萄糖对鹅肝细胞中靶基因INSIG1、COL3A1的调控。本实验对鹅原代肝细胞进行miR-29c抑制剂转染和葡萄糖处理,并定量检测靶基因COL3A1、INSIG1的表达情况。结果显示,100 mmol/L的葡萄糖能使INSIG1的表达显著上调,1niR-29c抑制剂能显著增强这种趋势,而100 mmol/L的葡萄糖能使C0L3A1的表达显著下调,但miR-29c抑制剂能显著抑制这种下调。这说明葡萄糖诱导的INSIG1和COL3A1的表达受到miR-29c的调控。7、miR-29c的上游转录因子预测及初步验证。首先设计miR-29c上游序列引物进行PCR扩增,经克隆测序获得上游序列。然后,通过Gene Regulation在线软件对鹅miR-29c的上游序列进行转录因子预测,筛选出转录因子RFX1。作为转录因子RFX1活性调节剂的维甲酸被用来处理鹅原代肝细胞。经检测,10μmol/L的维甲酸能使miR-29c的表达量显著上调。这初步说明转录因子RFX1可能介导了miR-29的表达调控。
【关键词】：miR-29c 鹅肥肝 靶基因 脂肪代谢 转录因子
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.33
【目录】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 缩略词表10-12
• 1 文献综述12-19
• 1.1 鹅肥肝研究进展12-13
• 1.2 miRNA概况13-15
• 1.2.1 miRNA的生成13-14
• 1.2.2 miRNA的作用机制14
• 1.2.3 miRNA与肝脏脂代谢14-15
• 1.3 miR-29c的研究概况15
• 1.4 miRNA的研究技术15-18
• 1.4.1 miRNA的克隆与高通量测序15-16
• 1.4.2 miRNA的表达16-17
• 1.4.3 miRNA的靶基因预测及验证17-18
• 1.5 实验目的、意义及主要研究内容18-19
• 2 材料与方法19-40
• 2.1 实验材料19-25
• 2.1.1 实验动物及饲养管理19
• 2.1.2 朗德鹅胚胎的孵化19
• 2.1.3 主要仪器设备19-20
• 2.1.4 常用实验试剂及试剂盒20-21
• 2.1.5 主要相关试剂的配制21-23
• 2.1.6 实验所需引物设计23-25
• 2.2 实验方法及步骤25-40
• 2.2.1 总RNA提取前的准备25
• 2.2.2 总RNA的提取25-26
• 2.2.3 miRNA反转录26
• 2.2.4 miRNA的荧光定量PCR26-27
• 2.2.5 靶基因预测27-28
• 2.2.6 总RNA反转录为cDNA28-29
• 2.2.7 荧光定量PCR(qRT-PCR)29
• 2.2.8 鹅血细胞基因组DNA提取29-30
• 2.2.9 pMIR-REPORT和PhRL-TK载体质粒扩繁30
• 2.2.10 载体质粒回收30-31
• 2.2.11 miRNA靶基因的靶位点PCR31-32
• 2.2.12 PCR产物检测32
• 2.2.13 PCR产物的切胶回收32
• 2.2.14 目的片段和载体双酶切及回收32-33
• 2.2.15 酶切产物连接33
• 2.2.16 转化及阳性克隆菌鉴定33-34
• 2.2.17 序列分析34
• 2.2.18 转染用质粒的提取34
• 2.2.19 CHO细胞复苏、培养34-35
• 2.2.20 CHO细胞转染35
• 2.2.21 双荧光素酶活性检测35-36
• 2.2.22 鹅原代肝细胞的分离与培养36-37
• 2.2.23 转染miR-29c mimics或inhibitor37
• 2.2.24 细胞RNA提取37-38
• 2.2.25 RNA反转录及荧光定量检测38
• 2.2.26 葡萄糖、胰岛素、脂肪酸、维甲酸分别处理鹅原代肝细胞38
• 2.2.27 细胞RNA提取、miRNA反转录以及miRNA定量检测38
• 2.2.28 转染miR-29c inhibitor并进行葡萄糖处理38-39
• 2.2.29 细胞RNA提取、反转录以及定量检测39
• 2.2.30 鹅miRNA上游序列PCR扩增39
• 2.2.31 PCR产物回收、连接、转化及阳性克隆菌鉴定39
• 2.2.32 序列比对分析39
• 2.2.33 miR-29c上游转录因子软件预测39
• 2.2.34 数据分析39-40
• 3 结果与分析40-50
• 3.1 填肥对鹅脂肪代谢相关组织中miR-29c表达的影响40
• 3.2 miR-29c的靶基因预测、筛选与验证40-43
• 3.2.1 miR-29c的靶基因预测40-41
• 3.2.2 miR-29c的候选靶基因在朗德鹅肥肝中的表达41-42
• 3.2.3 靶序列区扩增以及载体构建42-43
• 3.2.4 双荧光报告系统对miR-29c靶基因的验证43
• 3.3 miR-29c过表达或抑制后对鹅肝细胞中靶基因影响43-45
• 3.4 脂肪肝形成相关因子对鹅原代肝细胞中miR-29c表达的影响45-47
• 3.5 miR-29c介导葡萄糖对鹅肝细胞中靶基因INSIG1、COL3A1的调控47-48
• 3.6 调控鹅miR-29c表达的转录因子预测及初步验证48-50
• 4 讨论50-54
• 4.1 填肥对鹅脂肪代谢相关组织中miR-29c表达的影响50
• 4.2 朗德鹅miR-29c的靶基因预测与筛选50-51
• 4.3 朗德鹅miR-29c的靶基因验证51
• 4.4 miR-29c过表达或抑制后对鹅肝细胞中靶基因影响51-52
• 4.5 脂肪肝形成相关因子对鹅原代肝细胞中miR-29c表达的影响52
• 4.6 miR-29c介导葡萄糖对鹅肝细胞中靶基因INSIG1、COL3A1的调控52-53
• 4.7 调控鹅miR-29c表达的转录因子预测及初步验证53-54
• 5 全文结论54-55
• 参考文献55-62
• 致谢62-63
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录63-64

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本文编号：1095681