奶牛乳腺上皮细胞培养及干细胞鉴定

发布时间：2017-10-25 22:04

  本文关键词：奶牛乳腺上皮细胞培养及干细胞鉴定

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【摘要】：奶牛乳腺上皮细胞(dairy cow mammary epithelial cells,DCMECs)作为常用的体外实验工具,为奶牛乳腺发育、泌乳调控及乳腺生物反应器等方面的研究提供细胞模型。目前,DCMECs永生化细胞系的建立尚未成熟,需要在体外诱导并模拟生理条件,通过原代培养来获得具有泌乳功能的分泌性乳腺上皮细胞或构建三维立体的腺泡模型。乳腺是出生后发育的器官,青春期首次快速发育及妊娠期再次发育都与乳腺干细胞(mammary stem cells,MaSCs)活跃的自我更新及分化密切相关。研究表明乳腺中存在一定比例的干细胞,但区分鉴定这些多潜能干细胞的特异性分子标志仍不十分明确。一些激素及生长因子类物质在体内能够促进乳腺发育、调控泌乳,在体外能够促进乳腺上皮细胞增殖,影响细胞黏附、迁移、伸展和分化,并且涉及到对MaSCs的调控。激素和生长因子如何影响MaSCs扩增、分化并维持其多能性,以及调控乳腺上皮细胞生长、分化参与体外立体腺泡构建的机制值得深入研究。本研究以原代培养的DCMECs为实验模型,探讨短期内获得大量DCMECs的方法,筛选乳腺上皮干细胞新型分子标志,鉴定奶牛乳腺上皮干细胞,观察黄苷及IGF-Ⅰ对乳腺上皮细胞及乳腺上皮干细胞的影响。实验中采用胶原酶消化法体外培养DCMECs,通过绘制细胞生长曲线、核型分析、Western Blotting检测酪蛋白、荧光定量PCR检测泌乳相关基因等实验技术与方法评估原代(或传代)细胞的生长活性与泌乳潜能;利用激光共聚焦显微技术进行免疫荧光观察与分析,根据乳腺上皮干细胞分子标志表达、Brd U标记滞留的特点以及细胞分裂方式鉴定原代乳腺上皮细胞体外培养体系中的乳腺上皮干细胞。结果表明:(1)主要成分为胶原酶Ⅳ、透明质酸酶、DNA酶Ⅰ的消化液混合物在3h内高效率消化组织块,得到的原代及传代细胞是具有60条染色体,呈现典型上皮细胞形态,CK18表达阳性,生长活力旺盛,能够合成分泌β-casein的正常DCMECs,可作为后期实验材料。(2)在体外培养过程中,通过实时荧光定量PCR方法检测分析P0、P3、P6、P9细胞中催乳素、生长激素和胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)及其受体基因的表达变化,经过比较分析发现原代与传代后细胞在激素、生长因子及其受体mRNA水平上差异极显著降低(P0.01)。表明在非诱导泌乳分化培养条件下,脱离泌乳生理环境的DCMECs自身具有的泌乳调控基因表达迅速受到抑制。(3)本研究根据成体干细胞具有Brd U标记滞留的特点检测DCMECs中疑似乳腺干/祖细胞,同时分析两种新发现的MaSCs分子标志(FNDC3B和PROCR)的表达定位,验证应用它们指示乳腺上皮干细胞的可行性。结果显示,连续培养25d后Brd U标记滞留上皮细胞(label-retaining epithelial cells,LRECs)比例接近0.4%,极少数细胞呈FNDC3B或PROCR阳性,可以观察到不对称分裂细胞,但在一定培养时间内,DCMECs群体中能够保留一定比例疑似乳腺干/祖细胞,提示这些多能奶牛乳腺干/祖细胞在体外泌乳调控和乳腺腺泡重塑过程中可能发挥重要作用。(4)绘制细胞生长曲线,选择对数生长期添加黄苷及IGF-Ⅰ,通过实时荧光定量PCR方法检测分析原代及传代细胞中催乳素、生长激素和IGF-Ⅰ及其受体的基因表达,以及干细胞分子标志FNDC3B和PROCR m RNA的表达变化。添加黄苷及IGF-Ⅰ后,P0-P9细胞PROCR mRNA的表达量显著增高(P0.05),FNDC3B m RNA的表达量变化不显著(P0.05),PRL/P RLR、GH/GHR、I GF-I/I GF-IR m RNA的相对表达量在P0-P3细胞中有升高趋势而在P6-P9细胞中有下降趋势,提示黄苷及IGF-Ⅰ对上皮细胞及干细胞的增殖有一定的促进作用,并对早期乳腺上皮细胞泌乳基因表达呈正调控。
【关键词】：奶牛 乳腺上皮细胞 干/祖细胞 标记滞留 泌乳
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 前言12-19
• 1.1 奶牛乳腺上皮细胞研究进展12-14
• 1.1.1 国内外研究现状12-14
• 1.1.2 奶牛乳腺上皮细胞原代培养14
• 1.2 奶牛乳腺上皮干细胞研究进展14-18
• 1.2.1 干细胞14-15
• 1.2.2 乳腺上皮干细胞15-16
• 1.2.3 乳腺上皮干细胞的调控16-18
• 1.3 研究的目的与意义18-19
• 2 材料与方法19-28
• 2.1 实验材料19
• 2.2 实验仪器19-20
• 2.3 实验试剂20-21
• 2.4 实验方法21-27
• 2.4.1 原代奶牛乳腺上皮细胞分离培养与鉴定21-22
• 2.4.2 奶牛乳腺上皮干细胞的鉴定22-25
• 2.4.3 奶牛乳腺上皮细胞的生物学特性25-26
• 2.4.4 黄苷和IGF-Ⅰ对乳腺上皮干细胞标志分子和泌乳相关基因表达的调控26-27
• 2.5 数据处理27-28
• 3 结果与分析28-37
• 3.1 奶牛乳腺上皮细胞的分离培养及鉴定28-29
• 3.2 奶牛乳腺上皮干细胞的鉴定29-32
• 3.2.1 FNDC3B和P ROCR的表达定位29-31
• 3.2.2 Brd U标记滞留的疑似奶牛乳腺上皮干/祖细胞31-32
• 3.3 奶牛乳腺上皮细胞的生物学特性32-34
• 3.3.1 奶牛乳腺上皮细胞的染色体检测32
• 3.3.2 奶牛乳腺上皮细胞的生长曲线32-33
• 3.3.3 奶牛乳腺上皮细胞中泌乳相关基因表达33
• 3.3.4 奶牛乳腺上皮原代及传代细胞分泌 β-酪蛋白的检测33-34
• 3.4 黄苷和I GF-Ⅰ对奶牛乳腺上皮细胞及干/ 祖细胞的影响34-37
• 3.4.1 黄苷和IGF-Ⅰ对奶牛乳腺上皮细胞生长曲线的影响34-35
• 3.4.2 黄苷和IGF-Ⅰ对乳腺上皮干细胞标志分子和泌乳相关基因表达的影响35-37
• 4 讨论37-41
• 4.1 奶牛乳腺上皮细胞的基本特征37-39
• 4.1.1 奶牛乳腺上皮细胞原代培养及鉴定37-38
• 4.1.2 奶牛乳腺上皮细胞的生物学特性38-39
• 4.2 奶牛乳腺上皮干细胞的鉴定39-40
• 4.2.1 FNDC3B和PROCR是新型乳腺干/祖细胞标志39
• 4.2.2 奶牛乳腺上皮细胞群体中的干细胞39-40
• 4.3 添加黄苷和IGF-Ⅰ对奶牛乳腺上皮细胞群体的影响40-41
• 5 结论41-42
• 致谢42-43
• 参考文献43-50
• 附录50-51
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文51

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本文编号：1095680