植物精油对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞损伤的保护作用研究

发布时间：2017-10-26 07:08

  本文关键词：植物精油对LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞损伤的保护作用研究

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【摘要】：奶牛乳房炎是影响我国奶牛养殖业发展的主要疾病之一。近年来,关于奶牛乳房炎在细胞水平的研究逐渐受到人们的重视,奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,b MEC)是奶牛乳腺免疫的重要组成部分,也是研究奶牛乳房炎发病机理和筛选有效治疗药物的重要材料。植物精油是从植物中萃取而来的芳香物质,其分子量小,渗透性强,可被机体迅速吸收,研究发现其对奶牛乳房炎多种致病菌有良好的抑菌、杀菌效果。本研究通过b MEC的原代培养,获得纯化的b MEC;通过脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导,建立b MEC炎症模型;通过上皮细胞活力和形态学比较,分析植物精油对LPS诱导b MEC炎性损伤的影响,以及NF-κB信号通路中关键因子的表达,旨在探究植物精油对LPS诱导的b MEC炎性损伤的保护作用,为有效治疗奶牛乳房炎药物的筛选提供理论依据。1.奶牛乳腺上皮细胞的分离培养利用组织块法和酶消化法从无泌乳史奶牛乳腺组织中成功分离到了b MEC,具有b MEC的典型形态学特征,可表达上皮细胞特异性骨架蛋白-角蛋白18(CK-18)。在第2~8 d时生长曲线呈S型,表明细胞生长状态良好;10代以内的b MEC极化细胞少,传至20代后极化细胞显著增多。2.乳腺组织的冻存-80℃下在冻存液A(FBS:DMSO:DMEM/F12=7:2:1)和冻存液B(FBS:DMEM/F12:DMSO:HEPES/丙酮酸钠贮存液=10:7:2:1)中,分别快速冻存奶牛乳腺组织块(4~5 mm3),随后转移至液氮中保存。8个月后复苏乳腺组织,结果显示冻存液A中组织块成活率为50%,冻存液B中组织块成活率为56%。3.b MEC炎症模型的建立用基础培养基将LPS配制成0μg/m L、10μg/m L、50μg/m L、100μg/m L、200μg/m L 5种不同浓度,分别作用于b MEC 12 h,细胞活力检测OD值分别为0.62±0.05、0.61±0.09、0.46±0.06、0.31±0.07、0.02±0.01,表明随着LPS浓度的增大,细胞活力呈下降趋势。再分别用0μg/m L、10μg/m L、25μg/m L、50μg/m L、100μg/m L5种浓度的LPS分别作用于b MEC 12 h,细胞形态学观察和β-防御素、IL-1β、IL-8、TNFα基因表达检测结果表明,50μg/m L的LPS对细胞形态损伤较小,能显著上调炎性细胞因子表达量。本试验选用50μg/m L的LPS处理细胞12 h,建立炎症模型。4.四种植物精油对b MEC炎性损伤的影响分别用不同体积分数的香精油、茶树油、香樟油和桉树油处理b MEC 12 h,细胞活力测定与形态学观察结果显示,百里香精油、茶树油、香樟油和桉树油安全作用剂量(体积分数)分别为0.02%、0.04%、0.04%、0.03%。荧光定量PCR分析结果表明,0.01%的百里香精油、0.04%的茶树油、0.03%的香樟油和0.02%的桉树油能显著下调β-防御素、IL-1β、IL-8、TNFα以及NF-κB信号通路中的关键因子TRAF6、Bp65、Bp50的表达。综上所述,无泌乳史的育成奶牛乳腺组织-198℃冻存8个月,可用于分离培养bMEC;50μg/m L的LPS处理纯化的奶牛乳腺上皮细胞12 h,可用于建立b MEC炎症模型;一定浓度的百里香精油、茶树油、香樟油和桉树油有降低LPS损伤乳腺细胞的作用。
【关键词】：植物精油 脂多糖 奶牛乳腺上皮细胞 原代培养 炎性损伤
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-14
• 英文缩略表14-15
• 第一章 引言15-22
• 1.1 奶牛乳腺上皮细胞原代培养研究进展15-18
• 1.1.1 奶牛乳腺上皮细胞原代培养发展历程15
• 1.1.2 奶牛乳腺上皮细胞原代培养技术15-16
• 1.1.3 奶牛乳腺上皮细胞纯化方法16-17
• 1.1.4 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定技术17-18
• 1.2 奶牛乳腺上皮细胞应用研究18-19
• 1.2.1 奶牛乳腺上皮细胞用于奶牛乳房炎的研究18-19
• 1.2.2 奶牛乳腺上皮细胞用于泌乳调控的研究19
• 1.2.3 奶牛乳腺上皮细胞用于药物筛选的研究19
• 1.3 植物精油研究概况19-21
• 1.3.1 百里香精油研究概况20
• 1.3.2 茶树油研究概况20-21
• 1.3.3 香樟油研究概况21
• 1.3.4 桉树油研究概况21
• 1.4 本研究的目的与意义21-22
• 第二章 奶牛乳腺上皮细胞分离与培养22-33
• 2.1 材料22-23
• 2.1.1 试验动物22
• 2.1.2 主要试剂22
• 2.1.3 溶液配制22
• 2.1.4 主要仪器22-23
• 2.2 试验方法23-25
• 2.2.1 乳腺组织取样23
• 2.2.2 乳腺上皮细胞分离培养及纯化23-24
• 2.2.3 奶牛乳腺上皮细胞鉴定24-25
• 2.2.4 奶牛乳腺上皮扫描电镜下形态学观察25
• 2.2.5 奶牛乳腺上皮细胞传代25
• 2.2.6 生长曲线的绘制25
• 2.2.7 乳腺组织切片观察25
• 2.3 试验结果25-30
• 2.3.1 奶牛乳腺上皮细胞分离培养25-26
• 2.3.2 不同部位乳腺组织分离培养细胞结果对比26-27
• 2.3.3 奶牛乳腺上皮细胞纯化27-28
• 2.3.4 奶牛乳腺上皮细胞形态学特征28
• 2.3.5 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定28-29
• 2.3.6 奶牛乳腺上皮细胞的稳定性29
• 2.3.7 生长曲线的绘制29-30
• 2.3.8 乳腺组织切片观察30
• 2.4 讨论30-31
• 2.5 结论31-33
• 第三章 奶牛乳腺组织的冻存33-37
• 3.1 材料33
• 3.1.1 试验动物33
• 3.1.2 主要试剂33
• 3.1.3 主要溶液配制33
• 3.1.4 主要仪器33
• 3.2 试验方法33-34
• 3.2.1 乳腺组织取样33
• 3.2.2 奶牛乳腺组织冻存33-34
• 3.2.3 乳腺组织复苏及细胞培养34
• 3.2.4 奶牛乳腺上皮细胞的鉴定34
• 3.2.5 奶牛乳腺上皮细胞形态学观察34
• 3.3 结果34-36
• 3.3.1 冻存奶牛乳腺组织活性34
• 3.3.2 细胞形态观察34-36
• 3.4 讨论36
• 3.5 结论36-37
• 第四章 奶牛乳腺上皮细胞炎症模型的建立37-46
• 4.1 材料37
• 4.1.1 细胞37
• 4.1.2 主要试剂37
• 4.1.3 试剂配制37
• 4.1.4 主要仪器37
• 4.2 试验方法37-40
• 4.2.1 LPS细胞毒性检测37-38
• 4.2.2 形态学观察38
• 4.2.3 炎症因子表达量的检测38-40
• 4.3 结果40-44
• 4.3.1 LPS细胞毒性测定结果40
• 4.3.2 细胞形态学观察40-42
• 4.3.3 炎症因子表达量测定结果42-44
• 4.4 讨论44-45
• 4.5 结论45-46
• 第五章 四种植物精油对细胞损伤的保护作用研究46-55
• 5.1 材料与方法46-47
• 5.1.1 细胞来源46
• 5.1.2 主要试剂46
• 5.1.3 试剂配制46
• 5.1.4 主要仪器46-47
• 5.2 试验方法47-48
• 5.2.1 植物精油细胞毒性试验47
• 5.2.2 精油抗炎试验47
• 5.2.3 炎症因子表达量的检测47
• 5.2.4 NF-κB信号通路中关键因子表达量的测定47-48
• 5.3 结果48-53
• 5.3.1 增溶剂的细胞毒性作用比较48
• 5.3.2 植物精油的细胞毒性试验结果48-51
• 5.3.3 植物精油对炎症反应抑制效果51-53
• 5.3.4 植物精油对NF-κB信号通路中关键因子表达量的影响53
• 5.4 讨论53-54
• 5.5 结论54-55
• 第六章 全文结论55-56
• 参考文献56-63
• 致谢63-64
• 作者简历64

【参考文献】

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1 林杰;王旭荣;杨志强;王磊;张景艳;孔晓军;王学智;秦哲;王孝武;李建喜;;青海省某奶牛场顽固性乳房炎主要病原菌的分离鉴定与耐药性研究[J];动物医学进展;2015年12期

2 秦海燕;叶平;索志荣;;香樟精油自然挥发对肺炎小白鼠的保护作用[J];黑龙江畜牧兽医;2015年11期

3 泰东梅;刘红云;茅慧玲;汪海峰;王，

本文编号：1097557