C1EIS基因对鸡ESC向雄性生殖细胞分化的调控作用

发布时间：2017-10-29 20:31

  本文关键词：C1EIS基因对鸡ESC向雄性生殖细胞分化的调控作用

  更多相关文章： 鸡胚胎干细胞 鸡胚精原干细胞 CRISPR/Cas9 C1EIS

【摘要】：胚胎干细胞(Embryonic stem cell, ESC)向雄性生殖细胞的诱导分化受到许多内源性分化因子和外源诱导因素的调控。其中视黄酸(Retinoic acid, RA)、骨形成蛋白4 (Bone morphogenetic protein 4, BMP4)等外源诱导培养与Sta8 DAZL等内源基因调控形成复杂调控网络共同发挥关键作用。随着对ESC向雄性生殖细分化机制的深入了解,发现存在新基因特异表达,探索这些新基因功能对完善胚胎干细胞诱导体系,治疗不孕不育疾病具有重要意义。本研究利用CRISPR/Cas9高效基因编辑技术实现在鸡上基因敲除,探索精原干细胞特异表达基因C1EIS功能,为阐明生殖细胞发生及分化机制提供高效方法。本文主要研究如下：1前期通过RNA-seq技术发现C1EIS基因在ESC向SSC分化过程中,存在显著差异表达。通过RT-PCR获得如皋黄鸡C1EIS基因编码区并进行测序验证。生物信息学分析结果表明：C1EIS基因(基因登录号：XM_416004.2)编码144个氨基酸,属于不稳定的脂溶蛋白。C1EIS蛋白无信号肽,主要在细胞核中表达。存在2个O-糖基化位点和1个N-糖基化位点,可能含有磷酸化位点：二级结构中α螺旋占45.14%,p转角占4.17%,伸展片段占15.97,无规则卷曲占34.72%；系统进化树分析显示鸡C1EIS蛋白与绿头鸭进化关系密切,与牛等哺乳类动物同源性较低。2设计3对特异sgRNA序列,构建CRISPR/Cas9敲除载体。使用含1.7% DMSO培养基诱导培养细胞48小时后转染CRISPR/Cas9载体。利用菌液PCR, T7E1酶切和TA克隆测序检测CRISPR/Cas9敲除载体活性。结果表明C1EIS基因存在2-3bp碱基缺失,突变效率为20%。CRISPR/Cas9技术能够稳定的在鸡的细胞上实现C1EIS基因突变。利用qPCR克隆C1EIS基因,连接pcDNA3.0过表达载体。利用EcoRI和Kpn I双酶切获得C1EIS条带,表明pcDNA3.0-C1EIS过表达载体构建成功。3分别将CRISPR/Cas9载体,pcDNA3.0-C1EIS过表达载体转染ESC,转染48小时后换RA诱导培养基培养12天。采用形态学观察、免疫化学检测、流式细胞检测和QRT-PCR等方法检测C1EIS缺失与过表达对ESC向SSC分化的影响。结果表明C1EIS缺失的ESC与正常RA诱导组相比,第6天类胚体数目降低57%,且停止向SSC分化；第12天RA诱导组与过表达组形成类SSC, C1EIS敲除组无类SSC形成；细胞免疫化学检测表明C1EIS缺失导致integrin α6、 integrin β1蛋白表达量低于正常RA诱导组；流式分选结果表明C1EIS缺失integrin a6、 integrin β1双阳性细胞数为0.1%,对照组与过表达组为20.8%和19.7%。荧光定量PCR结果表明诱导4d后,C1EIS缺失组Sox2和Nanog基因表达量显著高于正常RA诱导组51%和42%；诱导12d后,integrin α6和integrin β1基因表达量显著低于正常RA诱导组72%和38%。在RA诱导ESC分化过程中,敲除C1EIS抑制SSC分化形成,证明C1EIS基因在调控家禽ESC向SSC分化上发挥重要作用。
【关键词】：鸡胚胎干细胞 鸡胚精原干细胞 CRISPR/Cas9 C1EIS
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S831
【目录】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-7
• 缩略词表7-10
• 第一章 文献综述10-18
• 1 诱导胚胎干细胞分化成雄性生殖细胞方法10-14
• 2 CRISPR/Cas9技术研究进展14-16
• 3 研究目的与意义16-18
• 第二章 鸡C1EIS基因cDNA序列的克隆与生物信息学分析18-27
• 1 材料与方法18-22
• 1.1 材料18-19
• 1.1.1 实验材料与试剂18
• 1.1.2 主要仪器和设备18-19
• 1.1.3 引物设计与合成19
• 1.2 方法19-22
• 1.2.1 鸡睾丸组织总RNA提取19
• 1.2.2 反转录睾丸组织cDNA19-20
• 1.2.3 C1EIS基因克隆20-21
• 1.2.4 C1EIS基因TA克隆测序21-22
• 1.2.5 C1EIS基因生物信息学分析22
• 2 结果22-26
• 2.1 C1EIS基因克隆22
• 2.2 C1EIS基因生物信息学分析22-26
• 2.2.1 C1EIS蛋白理化性质分析22-23
• 2.2.2 C1EIS蛋白信号肽与亚细胞定位分析23
• 2.2.3 C1EIS蛋白糖基化位点和磷酸化位点分析23-25
• 2.2.4 C1EIS蛋白质二级结构和三级结分析25
• 2.2.5 系统进化分析25-26
• 3 讨论26
• 4 小结26-27
• 第三章 C1EIS基因CRISPR/Cas9载体构建与活性验证27-37
• 1 材料与方法27-31
• 1.1 材料27-28
• 1.1.1 实验材料与试剂27-28
• 1.1.2 主要仪器和设备28
• 1.1.3 主要试剂配制28
• 1.2 方法28-31
• 1.2.1 C1EIS靶位点设计与合成28
• 1.2.2 寡核苷酸链杂交28
• 1.2.3 pcDNA3.0质粒酶切28-29
• 1.2.4 sgRNA,C1EIS与载体连接29
• 1.2.5 载体转化29
• 1.2.6 菌液PCR检测与过表达载体酶切鉴定29-30
• 1.2.7 鸡DF-1细胞培养传代30
• 1.2.8 细胞转染30-31
• 1.2.9 流式细胞分选31
• 1.2.10 T7E1酶切与TA克隆检测CRISPR/Cas载体活性31
• 2 结果31-35
• 2.1 载体结构与靶位点设计31-33
• 2.2 sgRNA鉴定33
• 2.3 pcDNA3.0-C1EIS载体鉴定33-34
• 2.4 鸡DF-1细胞培养34
• 2.5 CRISPR/Cas9载体转染条件探索34-35
• 2.6 CRISPR/Cas系统在DF-1细胞系上敲除C1EIS基因35
• 3 讨论35-36
• 4 小结36-37
• 第四章 C1EIS基因对鸡胚胎干细向雄性生殖细胞分化的影响37-45
• 1 材料和方法37-40
• 1.1 实验材料37
• 1.2 主要仪器和设备37-38
• 1.3 主要试剂38
• 1.4 主要试剂配制38
• 1.5 细胞处理及分组38
• 1.6 免疫细胞化学检测38-39
• 1.7 荧光定量PCR检测39
• 1.8 流式细胞检测39-40
• 2 结果40-44
• 2.1 鸡ESCs鉴定40-41
• 2.2 ESC形态学变化41
• 2.3 细胞免疫化学检测41-42
• 2.4 流式细胞检测42-43
• 2.5 Quantitative Real Time PCR(QRT—PCR)检测43-44
• 3 讨论44
• 4 小结44-45
• 全文结论与创新45-46
• 结论45
• 创新45-46
• 参考文献46-53
• 致谢53-54
• 硕士期间发表的论文54-55

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本文编号：1114581