外源谷胱甘肽促进牛体外受精胚胎发育的机制

发布时间：2017-10-29 22:17

  本文关键词：外源谷胱甘肽促进牛体外受精胚胎发育的机制

  更多相关文章： 牛 谷胱甘肽 体外受精胚胎 抗氧化 转录组测序

【摘要】：在胚胎的体外培养过程中会有氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的产生,正常情况下胞内产生和清除ROS的量会维持平衡状态,然而这种状态一旦遭到破坏就会使胞内积累过多的ROS,过量的ROS会损伤细胞,影响胚胎的发育能力。抗氧化剂谷胱甘肽(glutathione,GSH)能清除ROS,由ROS带来的氧化应激不能损伤到胚胎,最终对胚胎的体外发育和胚胎质量都能有所提高。然而,外源GSH如何进入体外培养的胚胎内,并有效清除ROS的机制并不清楚,因此本文采用胚胎工程、细胞生物学、分子生物学和转录组学方法揭示外源GSH的转运及其对胞内ROS的作用机制,及GSH处理对胚胎转录组水平的影响,为胚胎体外生产效率的提高提供理论基础。牛体外受精胚胎培养液中添加3毫摩尔每升(mmol/L,mM)GSH后继续培养到7天,分别统计各阶段的胚胎发育率及囊胚总细胞数;同时,测定受精后8h、18h、24h和32h胚胎内的ROS和GSH含量。采用酶联免疫测定受精后8h、18h、24h和32h胚胎中GSH运输和再合成相关酶(GGT、GGT、5-OPase、GCLC、GCLM和GSS)的活性,及其在基因的mRNA表达水平。结果,GSH添加后,卵裂率及囊胚率明显提高;细胞内ROS含量降低,GSH升高。此外,添加GSH后发现在受精32h时,GGT的mRNA表达量上升,GCLC和GSS的mRNA表达水平下降;在受精后18h时,GGCT的mRNA表达量下降,5-OPase和GCLM的表达量上升。与GSH转运和再合成相关的4种酶的活性也发生了相应的改变。其中,在受精后18h,γ-GCS的活性显著增高(P0.05),GGCT活性则显著降低(P0.05);在受精后32h,GGT的活性显著升高(P0.05),GSS的活性显著降低(P0.05)。说明添加GSH能显著提高体外胚胎发育能力。采用Illumina平台对8-16细胞期和桑椹期的牛体外受精胚胎,进行测序;筛选出差异基因进行功能注释和代谢途径分析;采用定量PCR对十个基因的表达水平进行检测,以验证测序结果的准确性;在获得的新转录本中挑选3组进行RNA和蛋白结构的预测。在对OOSP1,THAP9等10个基因的定量检测、测序结果的质量评价(碱基错误率、Q20、Q30、GC含量)、reads与牛基因组的比对及其在基因组的分布统计分析,均说明该测序结果准确、可靠。与已知的转录本相比,4个新转录本中均发现不同长度的新外显子;预测的蛋白结构中除包含各自的保守结构域(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的催化结构域、MAD同源结构域)外,还发现2个新的蛋白结构域(低复杂区、dwarfins蛋白家族B结构域)。在培养液中添加GSH能导致胚胎转录谱的变化,显著提高胚胎的体外发育能力。
【关键词】：牛 谷胱甘肽 体外受精胚胎 抗氧化 转录组测序
【学位授予单位】：河北工程大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823
【目录】：

• 缩略词（Abbreviation）5-7
• 摘要7-9
• Abstract9-14
• 第一章 文献综述14-23
• 1.1 早期胚胎发育14-15
• 1.2 谷胱甘肽在胚胎发育中的作用15-16
• 1.3 转录组测序的研究现状16
• 1.4 基因功能验证及新转录本功能预测16-21
• 1.4.1 生物信息学分析17-18
• 1.4.2 分子生物学技术18-20
• 1.4.3 蛋白水平分析20
• 1.4.4 表型分析20-21
• 1.5 本研究的目的意义21-23
• 第二章 谷胱甘肽对分裂前胚胎发育的影响23-36
• 2.1 试验材料23-24
• 2.1.1 试验材料23
• 2.1.2 主要仪器和设备23-24
• 2.1.3 主要试剂和耗材24
• 2.2 实验方法24-29
• 2.2.1 主要溶液的配制24-25
• 2.2.2 卵母细胞的采集和体外成熟培养25
• 2.2.3 体外受精25
• 2.2.4 体外培养25
• 2.2.5 囊胚总细胞数计算25-26
• 2.2.6 卵母细胞和合子内GSH、ROS含量的检测26
• 2.2.7 qRT-PCR检测基因表达情况26-28
• 2.2.8 与GSH转运合成相关酶的活性测定28-29
• 2.3 实验结果与分析29-33
• 2.3.1 谷胱甘肽对胚胎发育的影响29-30
• 2.3.2 对内源性GSH、ROS的影响30-31
• 2.3.3 对谷胱甘肽转运合成相关基因的影响31-32
• 2.3.4 对谷胱甘肽转运合成相关酶的影响32-33
• 2.4 讨论33-36
• 第三章 转录组测序质量评估36-42
• 3.1 实验材料36
• 3.1.1 实验材料36
• 3.1.2 主要仪器和设备36
• 3.1.3 主要试剂和耗材36
• 3.2 实验方法36-37
• 3.2.1 建库测序36-37
• 3.2.2 测序质量的控制37
• 3.3 实验结果与分析37-41
• 3.3.1 测序数据的质量情况汇总37-39
• 3.3.2 READS与参考基因组比对情况39-40
• 3.3.3 READS在参考基因组不同区域的分布情况40-41
• 3.4 讨论41-42
• 第四章 新转录本的预测及定量PCR验证42-49
• 4.1 实验材料42
• 4.1.1 实验材料42
• 4.1.2 主要仪器和设备42
• 4.1.3 主要试剂和耗材42
• 4.2 实验方法42-44
• 4.2.1 新转录本的ORF预测和功能预测42-43
• 4.2.2 cDNA的样品制备和定量检测43
• 4.2.3 引物设计及定量验证43-44
• 4.3 实验结果与分析44-48
• 4.3.1 新转录本ORF预测44-45
• 4.3.2 功能结构域预测45-47
• 4.3.3 定量PCR检测结果与转录组比较47-48
• 4.4 讨论48-49
• 第五章 全文总结49-50
• 参考文献50-55
• 致谢55-56
• 作者简介56-57
• 攻读硕士学位期间发表的论文57-58

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 范必勤,W.R.杜克洛;鼠猴体外受精研究[J];江苏农业学报;1989年01期

2 魏平华;张天佑;;猪体外受精研究综述[J];畜牧兽医科技;1989年02期

3 卫中;;牛羊体外受精研究取得重大进展[J];青海畜牧兽医杂志;1989年04期

4 盐谷康生;郭春润;;牛的体外受精[J];国外畜牧科技;1990年01期

5 孙国凤;;在静冈县着手牛体外受精卵移植事业[J];生物技术通报;1993年10期

6 孙秀娟;;小鼠体外受精的影响因素[J];中国奶牛;2011年04期

7 范必勤,熊慧卿,刘铁铮,徐晓波,邵春荣,B.G.勃拉吉特,W.R.杜克洛;家兔体外受精研究[J];江苏农业学报;1987年01期

8 安闻;;黄牛体外受精发育成功[J];东北农学院学报;1987年01期

9 锺生泉;唐维六;;多化性桑蚕品种的体外受精研究初报[J];广东农业科学;1987年03期

10 张一峰;哺乳动物体外受精研究进展[J];国外畜牧学(草食家畜);1988年03期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 许张晔;叶碧绿;;体外受精后出生的2岁幼儿生长发育的研究[A];首届沪浙妇产科学术论坛暨2006年浙江省妇产科学学术年会论文汇编[C];2006年

2 甘贤优;张波;周红;冯贵雪;舒金辉;刘茵;高璇璇;;体外受精治疗中取精困难患者的干预对策和效果评估[A];中华医学会第六次全国生殖医学学术会议专刊[C];2012年

3 王倩倩;朱依敏;吴明远;;体外受精母亲与子代健康随访分析[A];2009中国杭州生殖健康学术论坛暨浙江省计划生育学与生殖医学分会学术年会论文汇编[C];2009年

4 邓冰冰;王文军;李瑞岐;黄丽丽;张宁锋;区颂邦;欧阳能勇;;体外受精患者卵巢反应不良的后续治疗方案的比较[A];中华医学会第十次全国妇产科学术会议妇科内分泌会场（妇科内分泌学组、绝经学组、计划生育学组）论文汇编[C];2012年

5 贾秀芬;周燕华;刘慧雯;金明顺;;三种抗氧化剂对小鼠体外受精胚胎发育的影响[A];中国解剖学会第十一届全国组织学与胚胎学青年学术研讨会论文汇编[C];2009年

6 吴红;李厚达;;小鼠体外受精和精子冷冻的研究[A];中国实验动物学会第六届学术年会论文集[C];2004年

7 冯秀清;陈雅隽;钟淑琦;闫晓飞;董建将;雷蕾;;体外受精和孤雌活化过程中小鼠胚胎细胞骨架的动态变化[A];2007年中国解剖学会第十届全国组织学与胚胎学青年学术研讨会论文摘要汇编[C];2007年

8 江楠;刘霞;蔡文伟;常永富;华科;王玉洁;徐营;;小鼠超短时体外受精研究[A];2012浙江省计划生育与生殖医学学术年会论文集[C];2012年

9 王丽洁;邢华;孙强;;小鼠体外受精与胚胎移植影响因素的研究[A];动物生理生化学分会第八次学术会议暨全国反刍动物营养生理生化第三次学术研讨会论文摘要汇编[C];2004年

10 周灿权;;体外受精与胚胎移植技术临床进展[A];中华医学会第五届全国计划生育学术会议资料汇编[C];2004年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 冯卫东;英发明生育辅助“导航系统”[N];科技日报;2010年

2 麦迪信;无针装置体外受精更便捷[N];医药经济报;2002年

3 记者 晓姝 通讯员 史绍俊;国内外首例“试管犏牛”诞生[N];青海日报;2012年

4 刘霞;中药在提高受孕几率上优于西药[N];科技日报;2011年

5 尚喜峰 王共全;我省首次成功为体外受精减胎[N];山西日报;2000年

6 记者 钱铮;日允许使用第三方生殖细胞体外受精[N];新华每日电讯;2008年

7 陈立希;试管受精新法：母亲不再受激素之苦[N];新华每日电讯;2007年

8 记者 俞慧友 通讯员 何艳;我“体外受精胚胎遗传学诊断”达世界先进水平[N];科技日报;2013年

9 李修;家畜性别早知道[N];农民日报;2002年

10 张丽辉 刘廉君;生物技术助反刍家畜“早婚多育”[N];科技日报;2006年

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 谢兰;用于精子筛选及体外受精的微流控芯片的构建及应用[D];清华大学;2010年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 苏敏;ROCK蛋白在猪体外受精早期胚胎发育中的作用[D];内蒙古大学;2015年

2 徐江姐;论我国体外受精胚胎在婚姻关系中的法律规制[D];南昌大学;2015年

3 魏婕;体外受精胚胎法律地位及其归属[D];华东政法大学;2015年

4 聂玉林;精子因素对体外受精结局的影响及处理策略[D];南华大学;2015年

5 吕鹏;牦牛HSPA12B基因的克隆及其在体外受精胚胎中的定位表达[D];甘肃农业大学;2016年

6 于学颖;外源谷胱甘肽促进牛体外受精胚胎发育的机制[D];河北工程大学;2016年

7 许珊珊;接受体外受精—胚胎移植治疗的妇女的心理健康状况及其对受孕结果的影响[D];广西医科大学;2013年

8 王倩倩;体外受精母亲与子代健康状况分析[D];浙江大学;2008年

9 潘晓明;不明原因不孕患者体外受精方式的分析[D];浙江大学;2010年

10 贾佩;猪卵巢卵母细胞体外受精的研究[D];青海大学;2015年

，

本文编号：1114890