表达鼠CXCL13重组狂犬病病毒的构建及免疫原性的研究

发布时间：2017-10-31 21:08

  本文关键词：表达鼠CXCL13重组狂犬病病毒的构建及免疫原性的研究

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【摘要】：狂犬病(Rabies)是一种严重危害人和动物的烈性传染病,分布在全世界约150个国家。到目前为止,接种狂犬病毒疫苗仍是该病最简单有效的预防、控制方法,因此,开发安全、高效低廉的新型狂犬病疫苗仍具有重要意义。趋化因子CXCL13可以通过与CXCR5受体结合,趋化B淋巴细胞和滤泡辅助T细胞(T follicular helper cell,T_(FH))细胞进入二级淋巴滤泡,促使生发中心(Germinal center,GC)和记忆B细胞和高亲和力抗体的产生。鉴于CXCL13在体液免疫过程中的重要作用,我们构建了表达鼠CXCL13蛋白的重组狂犬病病毒LBNSE-CXCL13,通过小鼠感染狂犬病毒模型来探究CXCL13在狂犬病毒感染过程中作用和机制。具体研究结果如下:1.重组狂犬病病毒LBNSE-CXCL13在BSR和NA细胞上生长特性均与亲本毒株LBNSE相似,无显著差异;2.脑内接种4×106 FFU LBNSE-CXCL13病毒,小鼠体重变化率与LBNSE-GM-CSF组相似,与LBNSE组无显著差异,实验过程中小鼠无明显临床症状和死亡现象;3.肌肉免疫1×106 FFU狂犬病病毒,LBNSE-CXCL13组小鼠2-6周抗体平均水平明显较LBNSE-GM-CSF和LBNSE组高,且三组第9周抗体水平均高于0.5IU/ml;4.与LBNSE相比,LBNSE-CXCL13对小鼠体外骨髓DC激活明显,但不能显著激活体内血液和淋巴结中DC,且明显低于LBNSE-GM-SCF组;5.免疫小鼠后,在第7、14天LBNSE-CXCL13较LBNSE-GM-CSF和LBNSE能明显提高对T_(FH)和GC B细胞的激活;6.免疫后第2周肌肉攻毒50 LD50 CVS-24,发现LBNSE-CXCL13能显著提高小鼠的保护率(95%),明显高于LBNSE组(50%)及LBNSE-GM-CSF组(70%)。综上所述,本研究说明表达小鼠CXCL13的重组狂犬病病毒LBNSE-CXCL13可明显刺激机体持续产生高水平的中和抗体,有望成为一株高效的狂犬病疫苗。
【关键词】：狂犬病 重组狂犬病病毒 趋化因子CXCL13 滤泡辅助T细胞 疫苗
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-9
• 缩略语表(Abbreviation）9-11
• 1 文献综述11-22
• 1.1 狂犬病概述11
• 1.2 狂犬病病原学11-12
• 1.3 狂犬病病毒的致病机制和病理变化12-13
• 1.4 狂犬病的流行病学和防控13-14
• 1.5 狂犬病的预防和治疗14-15
• 1.6 狂犬病病毒的反向遗传学15-16
• 1.7 狂犬病毒疫苗的研究进展16-18
• 1.7.1 传统狂犬病毒疫苗16-17
• 1.7.2 新型狂犬病毒疫苗17-18
• 1.8 生发中心18-19
• 1.9 趋化因子CXCL1319-20
• 1.10 T_(FH)细胞及其表面分子20-22
• 2.目的与意义22-23
• 3 实验材料与方法23-38
• 3.1 实验材料23-26
• 3.1.1 细胞和病毒23
• 3.1.2 载体与质粒23
• 3.1.3 主要试剂23-24
• 3.1.4 相关试剂及配制24-25
• 3.1.5 主要仪器25
• 3.1.6 实验动物及手术器械25-26
• 3.2 实验方法26-38
• 3.2.1 鼠PMBCs的分离及CXCL13基因的克隆26-29
• 3.2.2 LBNSE-CXCL13感染性克隆的构建29-31
• 3.2.3 LBNSE-CXCL13的拯救31
• 3.2.4 LBNSE-CXCL13感染性克隆的鉴定31-32
• 3.2.5 LBNSE-CXCL13的扩增32-33
• 3.2.6 LBNSE-CXCL13毒价的测定33
• 3.2.7 LBNSE-CXCL13在细胞上的生长特性33
• 3.2.8 LBNSE-CXCL13体外bmDC激活情况33-34
• 3.2.9 LBNSE-CXCL13感染小鼠后DC、T_(FH)和GC B细胞激活检测34-36
• 3.2.10 LBNSE-CXCL13对小鼠致病性检测36
• 3.2.11 LBNSE-CXCL13免疫小鼠后中和抗体检测36
• 3.2.12 LBNSE-CXCL13对小鼠保护率检测36
• 3.2.13 FAVN法检测狂犬病病毒中和抗体36-38
• 4 结果与分析38-52
• 4.1 LBNSE-CXCL13感染性克隆的构建38-39
• 4.2 LBNSE-CXCL13的检测39-40
• 4.3 LBNSE-CXCL13体外生长特性40
• 4.4 动物实验40-44
• 4.4.1 LBNSE-CXCL13对小鼠致病性检测40-41
• 4.4.2 LBNSE-CXCL13免疫小鼠后中和抗体水平检测41-43
• 4.4.3 LBNSE-CXCL13对小鼠的保护率检测43-44
• 4.5 LBNSE-CXCL13对小鼠DC的激活检测44-49
• 4.5.1 LBNSE-CXCL13对小鼠bmDC的激活检测44-46
• 4.5.2 LBNSE-CXCL13对小鼠体内DC的激活检测46-49
• 4.6 LBNSE-CXCL13对小鼠T_(FH)和GC B细胞激活检测49-52
• 5 讨论52-55
• 6 结论55-56
• 参考文献56-65
• 致谢65

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本文编号：1123756