在转基因鼠中验证猪MyoG启动子驱动猪PPARγ基因的上调表达

发布时间：2017-11-05 12:17

  本文关键词：在转基因鼠中验证猪MyoG启动子驱动猪PPARγ基因的上调表达

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【摘要】：在近几十年猪育种中,国内外的研究一直注重猪瘦肉率的提高而忽略肌肉品质。肌肉品质一般表现为肉质的嫩度、多汁性和口味,肌内脂肪的提高能够使肌肉的嫩度、多汁性得到提高。本实验室已经构建了调节肌内脂肪含量的肌肉特异性表达载体pGL3-MyoG-PPARγ-Flag-poly(A)Signal,主要包括猪肌肉特异性表达基因肌细胞生成素(Myogenin,MyoG)的启动子和脂肪相关基因过氧化物酶体增殖激活受体γ(Peroxisome Proliferator-Activated Receptorsγ,PPARγ),质粒的活性在C2C12细胞中得到验证后进行线性化处理,利用原核显微注射法成功制备MyoG-PPARγ转基因鼠。本试验以转基因鼠为模型,从MyoG-PPARγ转基因鼠的表型、DNA水平、mRNA水平、蛋白水平这几个方面验证组织特异性启动子MyoG对MyoG-PPARγ转基因小鼠的影响和MyoG启动子的活性。最终证明肌肉特异性启动子MyoG可以驱动外源PPARγ基因在活体水平上调表达。主要研究结果如下:1、分别对4只首建鼠进行繁殖、建系。首建♂1鼠得到了稳定遗传的后代,截止目前已传至F5代。首建♂1转基因小鼠阳性率已达到95%,达到建系的标准。2、绘制小鼠1-12周龄的体重增长曲线,以及对3个阶段(1月龄、2月龄、3月龄)MyoG-PPARγ转基因鼠和FVB野生型鼠血清中与脂肪相关的部分指标检测,研究结果表明:每个时间段MyoG-PPARγ转基因鼠和FVB野生型鼠在体重增长方面没有显著性差异(p0.05);1月龄、2月龄MyoG-PPARγ转基因鼠和FVB野生型鼠血清中的总胆固醇和甘油三酯均差异显著(p0.05)。所检测的每只鼠的指标均在FVB型鼠正常范围之内。这两项结果确定外源基因的插入并不影响转基因鼠的健康。3、采用绝对定量PCR的技术,分析MyoG-PPARγ转基因鼠拷贝数,结果表明:首建♂1鼠的拷贝数是2.24,说明外源基因并不是单拷贝插入。通过对随机选择的F0-F5代转基因阳性鼠拷贝数的统计,发现随着繁殖代数的增加,MyoG-PPARγ转基因鼠后代外源基因拷贝数大多都增加,也有少部分降低。4、采用qRT-PCR技术,测定1月龄、2月龄、3月龄MyoG-PPARγ转基因鼠外源基因PPARγ以及其下游靶基因脂肪酸结合蛋白基因(Adipocyte Fatty Acid Binding Proteins,A-FABP)、脂蛋白脂肪酶基因(Lipoprotein Lipase,LPL)mRNA水平的表达量,发现MyoG-PPARγ转基因鼠相对于FVB野生型鼠均有显著性升高(p0.05)。纵向比较1月龄、2月龄、3月龄MyoG-PPARγ转基因鼠外源基因PPARγ的表达量,1月龄MyoG-PPARγ转基因鼠相对于FVB野生型鼠外源基因PPARγ的表达量提升最多。5、采用Western Blot、免疫组化技术检测外源基因PPARγ蛋白水平的变化,结果显示,MyoG-PPARγ转基因鼠相对于FVB野生型鼠PPARγ蛋白表达量有所提高。6、检测1月龄、2月龄、3月龄MyoG-PPARγ转基因鼠和FVB野生型鼠进行腿肌中甘油三酯含量,发现整个生长阶段MyoG-PPARγ转基因鼠甘油三酯的表达量都显著高于FVB野生型鼠(p0.05)。随着小鼠的生长发育,小鼠脂肪沉积逐渐增加。
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S828

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本文编号：1144166