禽腺病毒荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

发布时间：2017-11-05 19:05

  本文关键词：禽腺病毒荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

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【摘要】：禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAd V)是无囊膜、线性双股DNA病毒,属于腺病毒科、禽腺病毒属成员。该病毒可感染鸡、火鸡及其他禽类。FAd V可致鸡发生包涵体肝炎(Inclusion body hepatitis,IBH)、心包积水综合征(Hydropericardium syndrome,HPS)和肌胃糜烂(Gizzard erosions,GE)等疾病。禽腺病毒属中包含8个种,分为禽腺病毒A~E、鹅腺病毒A、隼腺病毒A、及火鸡腺病毒B。蛋鸡和肉鸡均可感染该病毒,通常3~5周龄较为易感。该病常与禽类其他病原混合感染,感染鸡只可继发再生障碍性贫血、肝炎及产蛋量下降等。FAd V呈世界性分布,病毒可经粪-口途径水平传播,也可垂直传播,给养禽业造成巨大经济损失。本研究建立FAd V荧光定量PCR(real-time PCR)检测方法,为FAdV的快速检测提供技术手段,同时也为疫病净化提供技术平台,对促进养禽业健康发展具有重要意义。对Gen Bank发表的FAdV-A、B、C、D和E种参考毒株的Hexon基因序列进行多重比对,选择保守区域设计兼并引物,使检测引物具有FAdV各个种的种间通用性。应用常规PCR方法从FAdV-D基因组中扩增Hexon-1基因片段,大小为191bp,将此片段克隆到p MD18-T载体,制备标准品,以标准品为模板进行real-time PCR的扩增,建立标准曲线。标准品在质粒浓度为1×1010拷贝/μL~1×104拷贝/μL检测范围内的错误率为0.0599,扩增效率为1.904,斜率为-3.575,具有良好的线性关系。对标准品1×1010拷贝/μL~1×104拷贝/μL浓度范围进行real-time PCR扩增,其中标准品的敏感性为1×103拷贝/μL。并对其分别进行组内重复和组间重复,组内重复变异系数分别为0.22%、0.24%、0.11%、0.27%、0.18%、0.35%和0.37%;组间重复变异系数(CV%)分别为0.50%、0.86%、0.73%、1.32%、1.06%、0.56%和0.78%。因此本研究建立FAd V荧光定量PCR检测方法具有良好的重复性及稳定性。应用建立的荧光定量PCR检测方法,分别对禽腺病毒FAdV-D种及FAd V-C种的最小检出滴度进行测定,对FAd V-D和FAd V-C种的检测下限均为102TCID50/ml,是常规PCR检测方法的10倍。说明本研究建立的检测FAd V荧光定量PCR的方法具有较好的敏感性。将禽腺病毒FAd V-D毒株以相同剂量和滴度(100EID50)分别以卵黄囊(6.5日龄)、尿囊膜(9日龄)、尿囊腔(9日龄)途径接种SPF鸡胚,采集鸡胚的组织包括脑、心脏、肠、肺脏、胸腺、肝脏、腺胃、肾脏、脾脏、法氏囊以及鸡胚尿囊液和鸡胚尿囊膜。结果表明不同接种途径对FAd V-D在SPF鸡胚中的增殖影响较大,卵黄囊途径接种SPF鸡胚,鸡胚尿囊膜及尿囊液中DNA拷贝数高于其他两种接种途径,其中经卵黄囊、尿囊膜、尿囊腔途径接种SPF鸡胚,鸡胚尿囊膜中DNA拷贝数分别为1.32×108拷贝/mg、2.89×105拷贝/mg及9.07×104拷贝/mg,接胚尿囊液中DNA拷贝数分别为4.99×104拷贝/mg、3.28×104拷贝/mg及1.32×104拷贝/mg。因此,FAdV-D在SPF鸡胚中最适接种途径为卵黄囊接种,病毒在鸡胚尿囊膜和尿囊液中良好增殖,可收获尿囊膜及尿囊液作为病毒储液。病毒在鸡胚肝组织中DNA拷贝数最高,为4.67×108拷贝/mg。此外,用Günes等已报道的real-time PCR检测方法对上述结果进行符合性检验,与本研究建立的real-time PCR方法检测结果相比,病毒在鸡胚组织中的分布和组织中的病毒载量具有良好的一致性。FAd V-D感染1日龄SPF鸡,于攻毒后每4天采集口咽和泄殖腔拭子,使用本研究建立的FAd V real-time PCR检测方法检测感染鸡只排毒情况,持续检测至攻毒后72d。结果表明,感染鸡只于攻毒后4d开始排毒,攻毒后72d仍可从感染鸡只口咽和泄殖腔拭子中检测到病毒,经口咽拭子检出率为7/10(70%),经泄殖腔拭子检出率为8/10(80%)。应用常规PCR检测方法对上述样品进行平行检测,感染鸡只于攻毒后4d开始排毒,至攻毒后72d,鸡只口咽和泄殖腔拭子均检测不到病毒。在攻毒后第8天,感染FAdV-D组的鸡群中有3只鸡发病严重、濒死,将3只濒死鸡安乐死处理,采集组织样品,real-time PCR检测病毒在感染鸡体组织分布情况。结果表明,感染鸡只各组织脏器中均有病毒存在,说明FAd V为泛嗜性病毒,但主要嗜性组织为肠和肝脏,在直肠中检测到病毒基因组拷贝数最高,在脾脏中病毒基因组拷贝数最低。分别使用本研究建立的real-time PCR和常规PCR方法对收集到的我国10个省份143份疑似FAd V感染鸡的组织病料进行检测。发现real-time PCR方法检测阳性率为63.6%(91/143),常规PCR方法检测阳性率为40.5%(58/143),说明本研究建立的FAdV real-time PCR检测方法在临床病料检测上具有良好的敏感性。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65
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本文编号：1145454