欧洲型PRRSV重组腺病毒疫苗构建及实验免疫研究

发布时间：2017-11-07 05:23

  本文关键词：欧洲型PRRSV重组腺病毒疫苗构建及实验免疫研究

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【摘要】：我国于1995年底首次报道猪繁殖与呼吸系统综合征(Procine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS),该病自发现至今已成为影响养猪业的主要疾病之一,引起该病的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(Procine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)。一直以来我国流行的主要是美洲型PRRSV及其变异株,然而近年来相继在国内有欧洲型PRRSV分离株的报道。欧洲型PRRSV于上世纪九十年代初对欧洲养猪业造成重大经济损失,国内尚无应对该病的有效疫苗及预防措施,国内欧洲型PRRSV的发现对PRRSV的防治提出了新的挑战。本研究以缺失型腺病毒为载体,构建表达欧洲型PRRSV LV株ORF3、ORF5目的基因的重组腺病毒,将所构建的重组腺病毒进行小鼠免疫试验及猪免疫试验,并对重组腺病毒疫苗的免疫效果进行分析。先以PRRSV LV株ORF3、ORF5及猪IL-18为目的基因构建穿梭质粒pacad-EU-ORF3、pacad-EU-ORF5、pacad-EU-ORF3-ORF5、pacad-IL-18及pacad-EU-ORF3-ORF5-IL-18。然后将所构建的穿梭质粒与骨架质粒pacad59.2-100以Pac I限制性内切酶线性化,共转染至HEK293细胞,包装重组腺病毒rAd-EU-ORF3、rAd-EU-ORF5、rAd-EU-ORF3-ORF5、rAd-IL-18及rAd-EU-ORF3-ORF5-IL-18。用蛋白免疫印迹(Western Blot)及间接免疫荧光(Indirect Immunofluorescence Assay,IFA)等方法对包装获得的重组腺病毒进行验证鉴定,结果均显示出重组腺病毒可表达GP3及GP5目的蛋白。不同目的基因之间以自裂解Linker连接,为验证自裂解Linker是否有裂解功能及裂解效率,包装重组腺病毒rAd-EU-ORF3-ORF5-EGFP。并将接种rAd-EU-ORF3-ORF5-EGFP的细胞于荧光显微镜下进行观察,可见重组腺病毒可高效表达绿色荧光基因(EGFP)。将所构建的重组腺病毒疫苗进行小鼠免疫试验,结果显示:重组腺病毒疫苗可显著提高小鼠体液免疫及细胞免疫水平,其中共表达GP3和GP5基因的免疫组小鼠特异性抗体水平要高于单独免疫的rAd-EU-ORF3及rAd-EU-ORF5组。35d时,特异性抗体水平最高的rAd-EU-ORF3-ORF5-IL-18是单独免疫的rAd-EU-ORF3及rAd-EU-ORF5组的1.29倍与1.10倍(P0.05)。中和抗体检测显示免疫35d时免疫组rAd-EU-ORF3-ORF5-IL-18中和抗体水平最高,中和抗体滴度在1:16以上(P0.05)。免疫后35d小鼠T淋巴细胞增殖水平显著高于14d淋巴细胞增殖水平,淋巴细胞亚群检测显示免疫rAd-EU-ORF3-ORF5组CD4+及CD8+水平为野毒组的2.3倍和1.4倍,免疫组rAd-EU-ORF3-ORF5-IL-18组CD4+及CD8+水平为野毒组的1.6倍和1.5倍,表明重组腺病毒疫苗可促进CD3+CD4+、CD3+CD8+淋巴细胞增殖。对重组腺病毒疫苗的残留检测显示重组腺病毒疫苗可在小鼠体内存留14d之久,表明重组腺病毒疫苗可对小鼠提供较长时间的免疫刺激。在小鼠免疫试验的基础上,将所构建的重组腺病毒疫苗进行猪免疫试验,免疫结果显示:各试验组抗体水平均有所提高,其中免疫rAd-EU-ORF3-ORF5-IL-18+Quil A免疫效果最好,GP3及GP5特异性抗体是不加佐剂组rAd-EU-ORF3-ORF5-IL-18的1.13倍和1.15倍(P0.05)。中和抗体检测显示多数组别的中和抗体滴度均达到1:16以上(P0.05)。淋巴细胞增殖及T淋巴细胞亚群检测显示显示重组腺病毒疫苗可有效刺激淋巴细胞增殖,CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞与野毒组相比差异显著(P0.05),表明当PRRSV再次侵入机体时,机体的T淋巴细胞可迅速增殖,发挥细胞免疫应答功能。对免疫动物攻毒保护试验也显示重组腺病毒疫苗可有效降低血液及组织中病毒载量,其中免疫rAd-EU-ORF3-ORF5-IL-18及rAd-EU-ORF3-ORF5-IL-18+Quil A组脏器的病毒载量为野毒组5%-10%,表明重组腺病毒可有效减少感染猪病毒血症的发生。综合分析,重组腺病毒疫苗可诱导小鼠及猪产生体液免疫及细胞免疫应答,并对免疫动物提供较好的保护作用。通过对重组腺病毒疫苗的研究,为欧洲型PRRSV疫苗的进一步研发奠定基础。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4

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本文编号：1151028