融合表达TGEV 6Ds与PEDV ps420非抗性标记重组干酪乳杆菌表达系统的构建及免疫效果评价

发布时间：2017-11-14 01:01

  本文关键词：融合表达TGEV 6Ds与PEDV ps420非抗性标记重组干酪乳杆菌表达系统的构建及免疫效果评价

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【摘要】：猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)是引起猪病毒性腹泻的主要病原,二者同属冠状病毒,所致疾病的临床特征相似,并多以混合感染。仔猪感染的死亡率最高可达到100%,给养猪业造成巨大损失。研究表明,黏膜免疫是有效的防治途径。因此,研究能有效预防TGEV与PEDV感染的口服疫苗具有重要的实践意义。本研究以TGEV S蛋白D抗原中和位点的6个核酸重复序列6Ds和PEDV S蛋白中和抗原表位区ps420核酸序列为靶基因,定向插入组成型乳酸乳杆菌表达载体p PG-T7g10-PPT构建了融合表达6Ds-ps420蛋白的重组表达质粒p PG-T7g10-6Ds-ps420。将阳性重组质粒电转入干酪乳杆菌L.casei 393,获得了阳性重组干酪乳酸杆菌p PG-T7g10-6Ds-ps420/L.casei 393。将重组菌p PG-T7g10-6Ds-ps420/L.casei 393在MRS培养液中37℃静置培养16 h,经Western-blot检测,目的蛋白获得表达,目的蛋白大小约为80 k Da。在此基础上,以增强型绿色荧光蛋白EGFP作为报告基因对构建的重组质粒pPG-T7g10-6Ds-ps420进行改造,将EGFP基因与融合基因6Ds-ps420串联,获得了重组质粒p PG-T7g10-EGFP-6Ds-ps420,电转入干酪乳杆菌L.casei393,获得了阳性重组菌p PG-T7g10-EGFP-6Ds-ps420/L.casei 393。对培养的重组菌进行Western blot和激光共聚焦显微镜检测,结果显示,目的蛋白获得表达。然后,通过酶切方法将重组质粒p PG-T7g10-EGFP-6Ds-ps420中的抗性标记氯霉素基因切除,平端自连后电转入干酪乳杆菌,通过流式细胞技术筛选非抗性标记(EGFP标记)的重组干酪乳杆菌pPG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei 393。经Western-blot鉴定,重组目的蛋白能够正确表达,大小约为110k Da。本研究以BALB/c小鼠为实验动物,对重组菌p PG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei 393的免疫原性进行初步评价。将小鼠随机分成4组:PPG-T7g10-6Ds-ps420/L.casei 393组、pPG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei 393组、pPG-T7g10-PPT/L.casei 393空载体组和PBS组。每只小鼠口服免疫2×109 CFU的干酪乳杆菌或200μl PBS,共免疫三次,免疫时间间隔为2周,每次连免3天,每天1次。采集不同时间点各组小鼠血清、粪便和外生殖道黏液样本,利用TGEV和PEDV全病毒作为包被抗原,通过间接ELISA方法检测免疫样本中的抗体水平。检测结果显示,p PG-T7g10-6Ds-ps420/L.casei 393免疫组和pPG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei 393免疫组小鼠Ig A和Ig G抗体水平均显著高于PBS组和pPG-T7g10-PPT/L.casei 393组,而pPG-T7g10-6Ds-ps420/L.casei 393免疫组和pPG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei 393免疫组之间抗体水平差异不显著。脾淋巴细胞增殖实验结果显示,5μg/m L的TGEV 6Ds抗原/PEDV ps420抗原具有显著的促进脾淋巴细胞增殖作用。免疫血清抗体中和病毒活性检测结果显示,p PG-T7g10-6Ds-ps420/L.casei 393免疫组小鼠抗血清对TGEV和PEDV的中和效价分别为1:100和1:112.2,pPG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei 393免疫组小鼠抗血清对TGEV和PEDV的中和效价分别为1:63.8和1:100,组间差异不显著。综上所述,本研究以EGFP为选择标记,成功构建了融合表达TGEV 6Ds和PEDV ps420蛋白的非抗性标记重组干酪乳杆菌系统p PG-T7g10-FEGFP-6Ds-ps420/L.casei 393,经动物免疫实验证实,该重组菌具有良好的免疫原性,为进一步探索新型猪传染性胃肠炎与猪流行性腹泻口服二联疫苗的研制奠定了基础。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.6

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本文编号：1183139