实验动物金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺支原体多重PCR检测方法的建立与初步应用

发布时间：2017-11-14 06:05

本文关键词：实验动物金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺支原体多重PCR检测方法的建立与初步应用

【摘要】：目的:实验动物是生命科学研究的基础和条件,实验动物的质量直接影响众多领域科学实验的准确性,也关系到实验动物从业人员和动物实验操作者的健康。因此,实验动物的微生物质量控制已纳入国家标准。肺支原体(Mycoplasma pulmonis)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是实验动物微生物检测需要排除的病原体,也是实验动物常见的易感病原体,在大小鼠、豚鼠、地鼠和兔中感染率可达到百分之几,甚至百分之几十,相对其它病原体感染率较高。目前对实验动物携带的金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺支原体的鉴定主要以分离纯化培养、生化试验等方法进行,存在费时费力、需要有经验的技术人员以客观指标加主观判断鉴定的缺点,如金黄色葡萄球菌从分离细菌到发出检测报告往往需要48h,绿脓杆菌需要长达72h,而肺支原体培养完成检测则需21天。而PCR(Polymerase Chain Reaction)技术以其简便、快速、准确等优点已在临床医学疾病诊断等领域得到广泛应用,理论上同样也可应用于实验动物的病原微生物检测,但普通PCR方法单管每次只能检测一种病原体,不能满足单管检测多种病原体的实际需要,更满足不了大样本、快速、准确的检测。多重PCR(multiplex PCR)可以在同一管反应体系中扩增出大小不同的核酸片段,具有快捷方便、高通量等优点。多重PCR如果应用在实验动物微生物检测中,可以同时检测多种病原体,适合大量实验动物微生物检测与鉴定,具有高灵敏性、高效性、高特异性和低成本性等优点。本研究目的是针对三种实验动物病原体金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺支原体,建立多重PCR检测方法,并与传统的微生物检测方法比较,检验多重PCR检测方法的可操作性和准确性。方法:1、将金黄色葡萄球菌标准株转接到SP琼脂培养基,培养24h后转接到血液琼脂培养基上进行分离与纯化培养,显微镜镜下观察,进行血浆凝固酶试验和甘露醇发酵试验;将绿脓杆菌标准株转接到NAC液体培养基,后转接到nac固体培养基上进行分离与纯化培养,显微镜镜下观察,生化鉴定,氧化酶试验,42℃生长试验;将肺支原体接到液体培养基中,一周后进行观察。2、通过文献查找肺支原体、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌特异性引物,使用blast分析各病原体引物特异性;进行pcr扩增,对扩增产物进行测序,通过生物信息学分析验证扩增产物正确性;3、优化pcr反应体系,检测pcr方法的特异性和敏感性。将模板dna按照10倍的比例进行梯度稀释,分别以稀释后的模板dna进行扩增;用接种针挑取菌落加入到装有普通营养肉汤的试管中,放入37℃恒温摇床中进行扩菌,将摇好的菌液按着10倍比例进行梯度稀释,转接到固体培养基上培养,提取菌液核酸进行pcr扩增;pcr扩增其他非目的菌进行特异性实验。4、将肺支原体、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的基因组dna在同一反应体系同时扩增,并且在反应体系中加入细菌通用引物做为内质控,调整和优化反应体系成分和反应条件,建立三种病原体多重pcr检测方法。选择具有实验动物生产资质的单位供应的动物:大小鼠共45只,采集实验动物回盲部内容物或粪便以及动物气管分泌物,提取核酸进行三种病原体多重pcr的检测,同时进行传统培养检测方法,将两种检测结果比较,检验多重pcr检测方法的可操作性和准确性。结果:1、金黄色葡萄球菌在sp固体培养基上形成黄色的菌落,转接血琼脂平皿形成灰白色、周围有β溶血环的菌落;菌体形态为革兰阳性球菌,排列成葡萄状;甘露醇发酵试验为阳性;血浆凝固酶试验为阳性。绿脓杆菌在nac琼脂平皿上形成扁平菌落,边缘不齐呈锯齿状,大部分菌落可产生绿色色素而致使培养基呈绿色;菌体特征为革兰阴性杆菌,菌体长短不一;各生化鉴定管阴阳性结果正确;氧化酶试验和42℃生长试验为阳性。肺支原体液体培养颜色由红色变为黄色。2、获得三种病原体的特异性引物,并通过blast比对验证引物的特异性,金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺支原体扩增产物大小分别为153bp、375bp和266bp,其测序结果分别与genebank对应序列(sequenceid分别为:gb|dq507378.1、dbj|ab926025.1、gb|kp836312.1)相似度分别为97.00%、98.90%和99.59%。3、PCR特异性实验:金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺支原体特异性实验结果,除标准菌株扩增出阳性条带外,其它菌种均扩增阴性;敏感性实验:金黄色葡萄球菌PCR扩增最小检出DNA核酸量为1pg、最小检出菌落数为2CFU;绿脓杆菌PCR扩增最小检出DNA核酸量为10pg,最小检出菌落数为14CFU;肺支原体PCR扩增最小检出DNA核酸量为1pg。4、建立了金黄色葡萄球菌、肺支原体、绿脓杆菌和细菌通用基因的多重PCR扩增体系,其产物经琼脂糖电泳出四个条带,片段大小从小到大分别为153bp、266bp、375bp和520bp。PCR检测实验动物24h培养物中的菌落,其结果与实验动物微生物检测结果一致;检测实验动物粪便,检测结果与传统培养鉴定方法相比有差异。结论:成功建立金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺支原体多重PCR检测体系,有较好的敏感性、特异性和重复性。用于实验动物微生物检测,检测结果与传统培养检测方法一致,并且多重PCR方法快速、简便、准确,初步验证了本检测方法具有良好的可操作性和准确性,为今后应用于实验动物微生物的检测奠定了基础。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.91

【参考文献】

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1 赵青;凤晓博;;食品中A族乙型溶血性链球菌的PCR检测[J];四川畜牧兽医;2015年07期

2 熊炜;林颖峥;魏晓锋;王艳;张强;李健;胡建华;黄忠荣;;淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒快速核酸检测方法[J];中国动物检疫;2015年04期

3 李继平;金剑;秦川;;实验动物在医学创新研究与发展中的作用[J];中国医药导报;2014年31期

4 冯育芳;邢进;巩薇;岳秉飞;贺争鸣;;应用PCR方法对三种新型实验动物钩端螺旋体感染情况的调查研究[J];中国比较医学杂志;2014年08期

5 戴方伟;宋晓明;卢领群;周莎桑;萨晓婴;吕宇;应华忠;;PCR-测序法对啮齿类动物汉坦病毒的检测和基因分型[J];中国实验动物学报;2014年03期

6 肖跃强;刘吉山;杨慧;沈志强;丁壮;;兔出血症病毒RT-PCR检测方法的建立与应用[J];中国动物传染病学报;2014年03期

7 陈菲菲;狄红霞;蓝乐夫;;金黄色葡萄球菌重要毒力因子的功能及其抑制剂研究进展[J];科学通报;2013年36期

8 王吉;卫礼;付瑞;李晓波;冯育芳;王淑菁;岳秉飞;贺争鸣;;长爪沙鼠小鼠肝炎病毒(MHV)RT-PCR检测方法的建立及初步应用[J];中国比较医学杂志;2013年02期

9 佟巍;;国内外实验动物病毒检测的比较[J];中国比较医学杂志;2012年11期

10 付瑞;岳秉飞;贺争鸣;;鼠痘病毒PCR检测方法的建立及在鼠源性生物制品检定中的应用[J];实验动物科学;2012年03期