双峰驼CYP2J基因的克隆与原核表达载体的构建

发布时间：2017-11-23 12:23

  本文关键词：双峰驼CYP2J基因的克隆与原核表达载体的构建

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【摘要】：CYP2J酶主要参与机体内源性物质代谢,尤其是对花生四烯酸和亚油酸代谢发挥着重要作用。本试验通过克隆CYP2J基因,构建其原核表达载体,为蛋白层面深入研究双峰驼CYP2J酶提供特异性抗体奠定基础。从双峰驼肾组织提取RNA,反转录后PCR扩增出双峰驼CYP2J基因,胶回收纯化后进行TA克隆,连接pMD18-T质粒并转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞中,提取质粒进行HindⅢ和KpnⅠ双酶切和PCR鉴定,并借助上述内切酶双酶切重组质粒pMD18-T-CYP2J后,连接于经同样双酶切处理的原核表达载体pET-32a,转化于大肠杆菌DH5α细胞中,并经HindⅢ和KpnⅠ双酶切、PCR鉴定及测序鉴定重组质粒。结果表明,在重组质粒pMD18-T-CYP2J和pET-32a-CYP2J双酶切电泳中均能得到约1500bp的特异性目的条带及两种质粒的特异性条带。以2种重组质粒为模板进行PCR扩增后电泳均能得到约1500bp的CYP2J特异性条带,测序结果与GenBank中公布的双峰驼CYP2J预测序列的相似度为99%。由此可见,本试验成功构建了双峰驼CYP2J基因原核表达载体pET-32a-CYP2J,为后续该基因的高效原核表达和蛋白层面的研究奠定了基础。
【作者单位】： 内蒙古农业大学兽医学院农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室;内蒙古阿拉善骆驼科学研究所;内蒙古骆驼研究院;
【基金】：国家自然科学基金项目(31560710)
【分类号】：S824
【正文快照】： CYP2J(Cytochrom e P450 2J subfamily)是存在于生物体内的超家族酶系CYP的一个亚族,其表达部位不同于其他CYP亚族,主要表达于肝外系统[1]。CYP2J酶主要参与机体内源性物质的代谢,尤其对机体花生四烯酸和亚油酸的代谢作用突出。花生四烯酸经CYP2J酶代谢,产生的EETs在保护血管

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1 张立群;RT-qPCR检测双峰驼体内CYP2J基因的分布与表达及其体外表达载体的构建[D];内蒙古农业大学;2015年

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本文编号：1218462