山羊SREBP-1A及SREBP-1C的克隆鉴定及功能初步研究

发布时间：2017-12-01 15:02

  本文关键词：山羊SREBP-1A及SREBP-1C的克隆鉴定及功能初步研究

  更多相关文章： 山羊 SREBP-1 乳腺上皮细胞 脂肪酸合成

【摘要】：固醇调节元件结合蛋白(Sterol Regulatory Element Binding Protein,SREBPs)是体内重要的核转录因子家族,对哺乳动物脂质及胆固醇生物合成过程有重要调节作用。SREBP-1是脂质合成过程中的主要调节因子之一,同时是奶牛泌乳期乳腺组织乳脂合成过程中的核心调节因子,对乳脂肪酸的从头合成、转运、去饱和、延伸、甘油三酯合成及脂滴生成及分泌过程均有重要的调控作用。研究发现,SREBP-1转录因子家族包括两个亚型:SREBP-1a及SREBP-1c,人和小鼠等模式动物中对该两个基因亚型的序列结构差异及功能差异已有过相关报道。但是,在反刍动物如牛及山羊上,SREBP-1家族两个亚型的序列差异仍未有过任何报道。本研究通过对西农萨能羊SREBF1基因的两个亚型SREBP-1a及SREBP-1c的启动子进行克隆,鉴定出了西农萨能奶山羊SREBP-1a、SREBP-1c基因序列差异,并构建该两个基因的pcDNA3.1超表达载体,转染山羊原代乳腺上皮细胞后,RT-qPCR方法检测SREBP-1a、SREBP-1c基因超表达后对脂肪酸代谢相关基因表达水平的影响,以及细胞内总胆固醇含量的变化,为进一步研究该基因家族在脂肪酸代谢及泌乳调控过程中的不同功能奠定基础。获得的主要研究结果如下:(1)通过对山羊基因组序列及SREBP-1基因cDNA序列的比对,利用启动子克隆技术,扩增得到山羊SREBP-1a及SREBP-1c基因的启动子序列,分别包括转录起始位点上游1 947 bp及2 012 bp。将克隆得到的启动子序列分别构建启动子荧光素酶报告基因载体(pGL3-basic),转染山羊原代乳腺上皮细胞,48 h后检测启动子活性,结果表明,克隆得到的启动子片段均为具有较高活性的启动子序列。(2)根据克隆得到的SREBF1基因家族两个亚型的启动子序列,分别设计引物扩增山羊SREBP-1a及SREBP-1c基因。结果表明,扩增得到1209 bp的SREBP-1a及1 137bp的SREBP-1c基因序列。两个亚型的序列差异主要在氨基末端,SREBP-1a基因的序列长度比SREBP-1c基因的序列长度多出72 bp,其余部分完全相同。(3)分别构建SREBP-1a及SREBP-1c基因的pcDNA3.1超表达重组质粒,并转染山羊原代乳腺上皮细胞。48 h后,RT-qPCR检测结果表明:与转染pcDNA3.1对照组相比,转染pcDNA3.1-SREBP-1a及pcDNA3.1-SREBP-1c处理组分别导致SREBP-1a及SREBF1基因显著上调10倍左右及30倍以上,同时导致脂肪酸合成相关基因脂肪酸合酶FASN、硬脂酰辅酶A去饱和酶SCD1、酰基辅酶A羧化酶ACACA、超长链脂肪酸延伸酶ELOVL6及磷脂磷酸酶LPIN1均显著上调(P0.05)。SREBP-1a及SREBP-1c的超表达导致细胞内胆固醇含量的上调(P0.05)。综上所述,本研究通过对西农萨能羊SREBF1家族两个亚型的启动子进行分别克隆,并根据两个亚型的启动子序列鉴定得到SREBP-1a、SREBP-1c基因的成熟形式核苷酸序列,分别构建pcDNA3.1超表达载体后转染山羊原代乳腺上皮细胞后,导致脂肪酸合成代谢的相关基因的mRNA表达量显著上调,细胞中总胆固醇的含量上调,而细胞中总甘油三酯含量无明显变化。研究结果为进一步明确SREBF1基因的两个亚型在乳腺脂肪酸代谢过程中的具体功能提供了理论基础及实验依据。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827

【相似文献】

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 杨云超;山羊SREBP-1A及SREBP-1C的克隆鉴定及功能初步研究[D];西北农林科技大学;2016年

，

本文编号：1241478