以基因为靶标的胶体金免疫层析法检测牛结核病

发布时间：2017-12-07 11:21

  本文关键词：以基因为靶标的胶体金免疫层析法检测牛结核病

  更多相关文章： 胶体金 牛分枝杆菌 结核分枝杆菌 试纸条 条件优化

【摘要】：目的:牛结核病(Bovine tuberculosis)能引起较严重的经济损失,其病原菌主要为牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis),偶见于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis),本研究以牛分枝杆菌AF2122/97与结核分枝杆菌H37RV的基因差异区为研究对象,将PCR技术和胶体金免疫层析法相结合,建立以基因为检测靶标的胶体金免疫层析法,并对检测条件进行优化,以区分牛分枝杆菌及结核分枝杆菌。方法:选择牛分枝杆菌特异基因Mb1582、Mb2048c和结核分枝杆菌特异基因Rv2647、Rv3426作为目的基因进行克隆,然后重新设计引物进行标记,在上游引物的5’端标记异硫氰酸荧光素,下游引物的5’端标记生物素,并分别以克隆完成的该基因质粒、牛分枝杆菌基因组、结核分枝杆菌基因组、水为模板进行PCR,以检测引物的特异性。之后完成胶体金免疫层析试纸条的组装,以柠檬酸三钠还原法制备胶体金,并确定胶体金与链霉亲和素偶联的最佳条件。金标链霉亲和素稀释液分别选择5%蔗糖、5%蔗糖+TritonX-100、5%蔗糖+TritonX-100+0.1%BSA、5%蔗糖+TritonX-100+1%BSA、5%蔗糖+TritonX-100+2%BSA,观测胶体金的稳定性及释放情况。选择流速较慢的硝酸纤维素膜,并将检测线兔抗异硫氰酸荧光素抗体浓度稀释为0.40mg/mL、0.60mg/mL、0.80mg/mL、1.00mg/mL及1.20mg/mL,质控线生物素浓度稀释为2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5 mg/mL及6 mg/m L、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL,将其分别划线于硝酸纤维素膜上,观测使检测线及质控线显色的最低浓度,该浓度即为胶体金试纸条的最佳标记浓度。用PBS、TBS、PBS+0.1%BSA、TBS+0.1%BSA作为样品稀释液,观察检测结果。完成胶体金免疫层析试纸条的组装后,将基因组分别稀释100-107倍,观测使试纸条显色的最低浓度,并与琼脂糖凝胶电泳的结果相比较。将标记的上下游引物和未标记的上下游引物组合,形成全抗原、半抗原及非抗原反应,检测试纸条显色情况。以常见病原菌的基因组为模板,检测胶体金免疫层析试纸条的特异性。结果:成功克隆Mb1582、Mb2048c、Rv2647、Rv3426基因;成功提取牛分枝杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞杆菌的基因组DNA;成功制备胶体金溶液;胶体金标记标链霉亲和素的最佳条件为PH8.5,每毫升胶体金溶液标记4.4μg链霉亲和素;金标链霉亲和素稀释液选用5%蔗糖+TritonX-100;检测线兔抗异硫氰酸荧光素多克隆抗体的标记浓度为1mg/mL,质控线生物素的标记浓度为7mg/mL;样品稀释液为TBS+0.1%BSA;胶体金免疫层析试纸条的最低检测级别为10-3ng/μL的基因组浓度,比琼脂糖凝胶电泳的灵敏度高100倍;胶体金免疫层析试纸条特异性较好,以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜铝假单胞菌、沙门氏菌基因组为模板时均为阴性结果;胶体金免疫层析试纸条的抗原-半抗原检测特异性较好。结论:成功组装胶体金免疫层析试纸条,并优化试纸条的最佳检测条件。结果表明,胶体金免疫层析试纸条的灵敏度是琼脂糖凝胶电泳的100倍,与常见病原菌无特异性反应,可以对牛分枝杆菌及结核分枝杆菌进行区分,为牛结核病的实验室诊断提供技术支持,对牛结核病的防控具有重要意义。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.23

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本文编号：1262226