山羊NLRP3炎症小体构成蛋白组织特异性表达和分布研究

发布时间：2017-12-09 09:11

  本文关键词：山羊NLRP3炎症小体构成蛋白组织特异性表达和分布研究

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【摘要】：NLRP3(NOD-like receptor protein 3)炎症小体是胞浆内由多种蛋白构成的一种蛋白复合体,它主要包括NLRP3、ASC(Apoptosis-associated speck-like protein)和caspase-1(Cysteinyl aspartate-specific proteasws)这三种蛋白。其中NLRP3蛋白是胞浆内重要的模式识别受体,能感知胞内病原微生物产物及代谢性应激,是构成炎症小体的核心部分。NLRP3炎症小体是半胱天冬蛋白酶活化所必需的反应平台,调控白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-18等促炎细胞因子的加工及活化,参与天然免疫系统的激活。它还调节caspase-1依赖的程序性细胞调亡,诱导细胞在炎性和应激的病理条件下死亡。本研究对海南黑山羊的NLRP3炎症小体构成蛋白的NLRP3和caspase-1基因进行了克隆和序列分析,通过重组原核表达纯化蛋白,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。采用实时荧光定量PCR和免疫组织化学技术研究了黑山羊各个组织中NLRP3、ASC和caspase-1的mRNA相对表达水平及蛋白的组织学分布。研究结果有助于阐明NLRP3炎症小体在羊炎症反应中的作用以及炎症小体的主要组成蛋白在体内的相对分布情况,为进一步探索NLRP3炎症小体在不同物种中的功能和进化提供了基础数据。本研究共进行了3部分研究,结果如下:1.海南黑山羊NLRP3和caspase-1基因的克隆及序列分析以海南黑山羊肝脏总RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增了海南黑山羊的NLRP3和caspase-1基因,获得的基因序列提交到GenBank(登录号分别为KM236558、KP999980)。运用分子生物学软件对所获得的序列进行了分析,结果表明,所克隆的山羊NLRP3基因ORF长3130bp,编码1031个氨基酸,蛋白分子量约为117.8kDa;caspase-1基因ORF长1212bp,编码403个氨基酸,蛋白分子量约为45.3kDa。2.海南黑山羊NLRP3和caspase-1蛋白原核表达与多抗制备分别以pMD18-T-NLRP3和pMD18-T-caspase-1为模板,扩增出了带有酶切位点的目的基因片段,亚克隆至表达载体PET32a(+),通过双酶切和序列测定证明成功构建了pET32a(+)-NLRP3和pET32a(+)-caspase-1表达质粒。将构建成功的表达载体转化至宿主细菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明这2种蛋白都成功诱导表达。通过SDS蛋白凝胶电泳检测纯化蛋白条带大小分别约为130kDa和63kDa,与其预测的大小相一致。将纯化后的蛋白制成油乳剂免疫新西兰大白兔,制备兔抗山羊NLRP3与caspase-1多克隆抗体。间接ELISA法检测结果表明这两种抗体效价均较高。用His标签抗体和免疫新西兰大白兔制备的纯化IgG抗体分别进行Western blot检测,结果表明制备的多抗特异性良好。3.海南黑山羊NLRP3、ASC和caspase-1基因和蛋白的组织学表达和分布的研究以海南黑山羊各组织中总RNA为模板,运用RT-PCR方法分别扩增了NLRP3、ASC、caspase-1、β-actin基因片段,溶解曲线分析NLRP3、ASC、caspase-1、β-actin基因片段引物的特异性。扩增的目的基因片段经琼脂糖凝胶电泳检测,分别在78bp、196bp、110bp和152bp处有一条相应的特异性条带,其大小与理论值相符。NLRP3、ASC和caspase-1基因在山羊的各组织中均有表达。其中NLRP3基因mRNA在脾脏中表达量最高,显著高于其他各检测组织(P0.05),而在大脑和淋巴结中表达量最低。ASC基因mRNA在肝脏中表达量最高,显著高于其他各检测组织(P0.05),在脾脏的表达量次之,而在心脏、肺脏和淋巴结中表达量最低。caspase-1基因mRNA在肝脏和脾脏中表达量最高,显著高于其他各检测组织(P0.05);而大脑、肾脏和心脏的表达显著低于其他组织(P0.05)。利用制备的NLRP3和caspase-1多克隆抗体以及本实验室先前制备的ASC抗体,通过免疫组织化学技术对NLRP3、ASC和caspase-1蛋白在海南黑山羊各个组织的分布进行了研究。结果表明,海南黑山羊这NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的分布极其相似,在心脏和脑呈现弱至中强阳性反应,但在肝、脾、肺、肾和淋巴结中呈强阳性反应。心肌细胞呈弱阳性至中强阳性,心肌间结缔组织呈阴性;肝细胞质呈现强阳性反应,部分细胞核呈现阳性;脾脏网状内皮细胞强阳性,淋巴细胞与脾小结呈弱阳性;肺支气管呈现强阳性,肺泡上皮细胞呈现弱阳性反应;肾小管上皮细胞呈强阳性,肾小球和肾小囊细胞呈阴性;大脑皮层部分基质与小胶质细胞呈中至强阳性,神经元细胞呈弱阳性;淋巴结生发中心呈强阳性,弥散淋巴组织呈弱阳性。
【学位授予单位】：华南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S827
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本文编号：1269836