猪胸膜肺炎放线杆菌OmpD、ApxⅣA蛋白表达及其免疫原性初步研究

发布时间：2017-12-15 00:03

  本文关键词：猪胸膜肺炎放线杆菌OmpD、ApxⅣA蛋白表达及其免疫原性初步研究

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【摘要】：猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)属于巴氏杆菌科(Pasteurella),放线杆菌属(Actinobacillus)。可引发猪胸膜肺炎或胸膜炎,死亡率高,由于APP血清型多,交叉保护力差,目前没有完全有效的疫苗[1]。为研制高效疫苗,本试验表达了ApxⅣA和OmpD蛋白并初步研究了其免疫原性。1.OmpD基因的扩增及其生物信息学分析根据GeneBank上3型APP全基因中的D15/omp基因序列,设计一对特异性引物,利用PCR方法扩增获得了1806 bp基因序列。通过DNAstar比对分析,核苷酸同源性为99.4%~99.8%,氨基酸同源性在98.7%~99.5%之间,同源性极高。生物信息学预测结果表明其抗原性和稳定性良好。2.OmpD截短基因原核表达在APP OmpD基因序列扩增基础上,构建了重组表达质粒pET32a-ompD,并转入Rosetta感受态细胞,经0.4mmol/L IPTG诱导4.5 h,表达出大小约为87 KD带有His标签的包涵体蛋白。Western Blot试验显示初步纯化的蛋白反应原性良好,为小鼠免疫试验提供抗原基础。3.ApxⅣA蛋白表达及间接ELISA优化以2.5μg/m L r ApxⅣA包被酶标板,5%明胶封闭2 h;血清稀释度为1:50,作用60 min;酶标二抗稀释度为1:3000,反应1.5 h条件最佳。阴阳性血清临界值为0.697。运用建立的ELISA方法和凝集试验分别对江西部分地区规模化猪场不同阶段的147份血清样品进行检测,母猪和公猪APP抗体阳性率分别为97.47%、98.73%,肥猪阳性率皆为100%,保育猪阳性率分别为18.75%、12.50%,小猪的阳性率分别为26.19%、7.14%,两者检测结果基本一致,说明建立的ELISA方法具有一定的可行性。4.ApxⅣA和OmpD蛋白免疫原性初步研究本试验分别表达了ApxⅣA和OmpD蛋白,与弗氏佐剂按照一定比例混合乳化制成亚单位疫苗免疫小鼠,终浓度为100μg/mL。每周采血检测小鼠抗体水平,三免一周后攻毒观察小鼠症状,另设甲醛灭活疫苗组、PBS对照组。结果表明:rApxⅣA组与rApxⅣA+rOmpD组疫苗一免14天后开始产生抗体,apxⅣ抗体效价较高,免疫原性较好;而灭活疫苗组二免14天后开始产生抗体,抗体水平较低。小鼠保护力试验表明试验组疫苗有一定的保护力,疫苗Ⅱ组效果最好,疫苗Ⅲ组次之,疫苗I组最差。
【学位授予单位】：江西农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.61

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本文编号：1289852