H3亚型禽流感病毒中国分离株的遗传进化分析及其致病性的研究

发布时间：2017-12-19 14:14

  本文关键词：H3亚型禽流感病毒中国分离株的遗传进化分析及其致病性的研究　出处：《中国农业科学院》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：H3亚型流感病毒宿主非常广泛,除感染自然宿主鸟类外,该亚型病毒可感染猪、犬和马等多种哺乳动物和人类。在中国,活禽市场中的鸡、鸭、鹌鹑、珍珠鸡、鸽子等家禽长时间混养,为禽流感病毒的传播、重组和跨种传播提供了可能。在多种亚型流感病毒共存环境中,H3亚型流感病毒的重排变异率会明显提高,而且,我国H3亚型禽流感病毒的遗传进化和致病性仍有很多未知。本实验对2009至2011年间于上海、浙江、江苏、广东和河北等地活禽市场采集的家禽的咽拭子进行了流感病毒分离,鉴定分型得到7株H3亚型流感病毒,系统命名为A/duck/Shanghai/120-1/2009(H3N8),A/duck/Nanjing/A1591-1/2010(H3N8),A/chicken/Nanjing/B854-2/2011(H3N8),A/duck/Hebei/B1645-2/2011(H3N2),A/duck/Hebei/B1646-2/2011(H3N2),A/duck/Hebei/B1647-1/2011(H3N2)和A/duck/Shanghai/74-1/2009(H3N2)。为进一步对七株病毒进行遗传进化和氨基酸序列分子特征的分析,我们提取七株病毒的总RNA,反转录得到病毒cDNA,使用A型流感病毒通用引物扩增出每株病毒的8段基因,测序得到7株分离株的全基因序列。使用Lasergene 7.0软件编辑分析氨基酸序列分子特征,使用MEGA6.0软件中的邻接法分别绘制8段基因的进化树。遗传进化分析表明,除了B854-2/H3N8和A1591-1/H3N8的NA基因属于北美分支外,其他分离株的全部基因都在欧亚分支聚集。值得注意的是,进化树显示120-1/H3N8的NA基因与流行于韩国的H5N8高致病性毒株的进化关系密切,河北分离株B1645-2/H3N2、1646-2/H3N2和B1647-1/H3N2的PB2,PB1,NP和NS基因出现了同样的情况。对分离毒株的氨基酸序列特征进行分析,HA基因裂解位点氨基酸序列均为PEKQTR/GLF,表明7株病毒的均为低致病毒性禽流感病毒。HA蛋白226与228位点的氨基酸序列特征说明这些毒株主要识别禽源α-2,3-唾液酸受体。PB2蛋白上的627和701位分别为E和D,没有发现对哺乳动物呈高致病力的氨基酸位点。NA蛋白序列特征表明7株病毒对神经氨酸酶抑制剂均敏感。B1645-2/H3N2和B1646-2/H3N2毒株的M2蛋白上有S31N突变,表明这两株病毒可以耐受M2离子通道抑制剂。为研究7株病毒的细胞生长特性,将7株纯化后病毒以0.01 MOI分别感染六孔板中长至80%的MDCK细胞、A549细胞和DF1细胞,使用含有TPCK-Trypsin的无血清高糖DMEM培养液维持。在接毒后12、24、48、72 h分别收集其细胞上清,每份样品重复3次。所有细胞上清样品使用9-10日龄的普通鸡胚测定其鸡胚半数感染量(EID50),根据不同时间点细胞上清中病毒的滴度(EID50/mL)绘制7株病毒在MDCK、A549和DF1细胞上的生长曲线。H3N2亚型中B1646-2与B1647-1毒株在感染后48h和72h在A549细胞上的复制效率高于其他H3N2亚型毒株。7株病毒在A549和DF1细胞上复制时,在各个时间点细胞上清的病毒滴度都低于MDCK细胞。为研究这7株H3亚型禽流感病毒分离株对哺乳动物的致病性,分别以106 EID50的剂量经鼻腔接种6周龄BALB/c小鼠,记录接种后0-14天小鼠体重的变化,并对各组织中的病毒进行分离和滴度测定。结果显示,7株禽流感病毒都能够在小鼠的鼻甲骨和肺脏中复制,但是均不致死小鼠。肺部组织病理结果显示,所有的H3病毒引起的轻度支气管间质性肺炎,表现为中性粒细胞浸润和肺泡上皮损伤。同时为了解这7株H3亚型禽流感病毒对家禽的致病性,根据系统进化树和小鼠致病性实验结果选取B1646-2/H3N2、B854-2/H3N8和120-1/H3N8为代表毒株,以106EID50的剂量经鼻腔接种6周龄SPF鸡,分别检测接种后第3、5、7天的咽和泄殖腔拭子和第4天各脏器中的病毒滴度。三株代表毒株对鸡表现为低致病性,只有B1646-2/H3N2能够在鸡体内进行复制并可能会通过口咽和泄殖腔排毒。总而言之,我国H3亚型禽流感病毒发生了明显的基因重组,导致部分毒株中来源于北美分支的N8基因替换了来源于欧亚分支的NA基因;所有H3病毒分离株对鸡和小鼠均表现为低致病性,但是这些病毒不经过适应就可以在哺乳动物模型小鼠的肺和鼻腔中复制,其对人类健康的威胁不容忽视。
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

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本文编号：1308273