人LL-37基因真核表达载体的构建及在细胞中的表达与鉴定
本文关键词：人LL-37基因真核表达载体的构建及在细胞中的表达与鉴定 出处：《甘肃农业大学》2016年硕士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】：奶牛乳腺生物反应器(Mammary Gland Bioreactor)是将外源基因插入到奶牛的乳腺器官中并进行特异性表达,生产转基因奶牛的一项技术。特异性强、稳定性好、效率高等优点使其在食品药品、医疗、工业生产以及畜牧养殖等行业具有广泛的利用价值。首先,奶牛的乳房是纯天然的高效合成蛋白质的器官,其优秀的渗透屏障功能可以限制外源基因进入体循环中,减少对转基因奶牛的损伤。其次,奶牛的高泌乳量可以源源不断地生产人类所需要的药用蛋白。除此之外,奶牛乳腺生物反应器还可以改变牛奶的组成成分,使其更加接近于人乳,具有更高的利用价值。抗菌肽是广泛存在于人体、动物、植物、昆虫体内的一种小分子多肽,是机体天然免疫的重要组成成分之一。抗菌肽具有广谱抗菌活性,对细菌、真菌、病毒及肿瘤细胞均有拮抗作用,并且不易产生耐药性。随着青霉素、链霉素等传统抗生素的长期作用,很多细菌都产生了明显的耐药性。经研究发现,内源性抗菌肽因其安全、有效的特点引起了诸多学者的关注,从而取代传统抗生素成为抗病原微生物的新武器。hCAP-18(human Cathelicidin Antimicrobial Peptide 18KDa)是目前在人体内发现的抗菌肽Cathelicidin家族中的唯一成员,经酶解释放出的C端片段被称为LL-37。LL-37因其N端前两个氨基酸残基为亮氨酸(L)并且氨基酸残基总数为37而得名,又称LL-37/hCAP-18。抗菌肽LL-37在人体中分布广泛,除具备抗微生物功能外,还具有中和内毒素及免疫调节等作用,为今后的感染性疾病、免疫性疾病、新型药物的开发和临床治疗等方面的研究拓宽思路。因此,本研究以分子生物学手段为基础,研发新型药用蛋白为目标开展研究工作。构建pcDNA3.1-LL-37真核表达载体并检验其在奶牛乳腺上皮细胞和奶牛胎儿成纤维细胞中的表达情况。本研究采用RT-PCR技术,从人的血样中扩增出LL-37基因片段,并将其连接至pcDNA3.1-His-V5(+)载体,经Xho I单酶切鉴定以及测序等方法证实真核重组质粒的正确性。通过脂质体介导的方法将真核重组质粒pcDNA3.1-LL-37转入奶牛乳腺上皮细胞和奶牛胎儿成纤维细胞中,经G418药物筛选获得上述两种稳定的阳性细胞株,并且利用RT-PCR和Western Blot检测目的基因在转录及翻译水平的表达情况。RT-PCR结果显示,经转染的乳腺上皮细胞和胎儿成纤维细胞均能够扩增出523bp的LL-37基因。qRT-PCR结果发现,LL-37mRNA在转染后的不同时期均有表达,并且两种细胞稳定转染的表达量均为最高。通过SDS-PAGE电泳,均获得了约17kDa的目的蛋白。结果表明,LL-37基因成功整合至奶牛乳腺上皮细胞和胎儿成纤维细胞中并能够正确表达,为构建分泌LL-37蛋白的奶牛乳腺生物反应器提供相关理论依据。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S823;Q78
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，本文编号：1320083
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