PK-15细胞与三种益生菌共培养抗TGEV作用及IFN-γ、IL-6mRNA表达

发布时间：2017-12-25 05:04

  本文关键词：PK-15细胞与三种益生菌共培养抗TGEV作用及IFN-γ、IL-6mRNA表达　出处：《东北农业大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)可以感染各种年龄和品种的猪,尤其是两周龄以内的仔猪,其死亡率高达100%,呕吐、严重腹泻、脱水为主要的临床特征,是引起仔猪腹泻的重要病原体,给养猪业造成巨大的经济损失并严重威胁其健康发展。益生菌具有提高动物生长性能、增强机体免疫力和治疗腹泻等疾病的作用,因而在畜牧业受到广泛地关注。为了模拟猪肠道内环境,探究细胞与益生菌间的相互作用对于维持生理稳态以及对细胞生长繁殖的影响,鉴于PK-15细胞是TGEV的易感细胞,所以本实验利用Transwell小室在体外建立PK-15细胞与益生菌共培养模型,通过台盼蓝染色摸索该共培养体系加入益生菌菌体的浓度、PK-15细胞与益生菌的共培养时间等条件。以共培养体系为平台,接入TGEV通过MTT比色法检测其抗TGEV效果,初步研究益生菌-细胞-病毒三者之间的相互作用关系。此外,通过实时荧光定量PCR检测PK-15细胞产生的抗病毒细胞因子IFN-γ和IL-6 m RNA的表达量,探索细胞在益生菌作用下的抗病毒效应。在体外PK-15细胞与益生菌共培养模型中,通过台盼蓝染色检测不同益生菌菌体浓度和不同共培养时间组合条件下PK-15细胞的存活率,结果表明:不同的益生菌菌体浓度、不同的共培养时间,PK-15细胞的存活率不同。当c≤108 CF U/m L且t≤24 h时,P K-15细胞的存活率较高,达90%以上;当c≤1012 CF U/m L且t≤3h时,P K-15细胞的存活率可达80%以上,即在上述两种情况下,PK-15细胞与益生菌共培养成立。用MTT比色法检测不同浓度的益生菌与PK-15细胞共培养3 h及浓度均为108 CF U/m L的益生菌与PK-15细胞共培养不同时间,其共培养的抗TGEV效果,结果表明:在PK-15细胞与益生菌共培养体系中,当益生菌的浓度约为108 CF U/m L及当共培养时间延长到12 h左右对TGEV的抑制率较高,因此108 CF U/m L为益生菌的最佳浓度,12 h为P K-15细胞与益生菌共培养的最佳时间,并且两种情况下,对TGEV的抑制程度均为:枯草芽孢杆菌共培养组屎肠球菌共培养组食淀粉乳杆菌共培养组。浓度为108 CF U/m L的益生菌与P K-15细胞共培养12 h后接种TGEV,检测不同时间点TGEV滴度,其半数组织培养感染剂量负对数的变化曲线随时间的增加,呈先上升后下降的趋势。在PK-15细胞与枯草芽孢杆菌共培养体系中,当收集TGEV时间点为48 h时,其半数组织培养感染剂量的负对数达到峰值为3.87;在PK-15细胞与屎肠球菌共培养体系中,当收集TGEV时间点为24 h时,其半数组织培养感染剂量的负对数达到峰值为5.16;在PK-15细胞与食淀粉乳杆菌共培养体系中,当收集TGEV时间点为48 h时,其半数组织培养感染剂量的负对数达到峰值为4.55。在共培养体系中,每个处理组的TGEV的平均滴度均小于正常病毒组,因此PK-15细胞与益生菌共培养能降低TGEV的滴度,降低程度为:枯草芽孢杆菌组屎肠球菌组食淀粉乳杆菌组。将六孔细胞培养板铺满单层的PK-15细胞进行如下分组处理:正常细胞对照组(Control组)、TGEV感染组(TGEV组)、与浓度为108 CF U/m L枯草芽孢杆菌共培养12 h组(BS+Cell组)和与浓度为108 CF U/mL枯草芽孢杆菌共培养12 h后感染TGEV组(BS+Cell+TGEV组)然后分别在1 h、3 h、6 h、12 h、24 h收集PK-15细胞样品实时荧光定量PCR检测不同时间点各组PK-15细胞中IFN-γ和IL-6 mRNA表达量的变化,结果表明:PK-15细胞与枯草芽孢杆菌共培养后感染TGEV能刺激IFN-γ和IL-6 m RNA表达量增加,作用效果为先快速增加,后逐渐减小。BS+Cell+TGEV组在3 h、6 h时均显著刺激IFN-γm RNA表达量增加,在1 h、3 h时均能显著刺激IL-6 m RNA表达量增加,在3 h时IFN-γ和IL-6mRNA表达量达到最大值。TGEV和枯草芽孢杆菌也都能刺激PK-15细胞IFN-γ和IL-6 m RNA表达量增加,并与BS+Cell+TGEV组有相同的趋势,但TGEV组和枯草芽孢杆菌组只在6 h时显著刺激IFN-γm RNA表达量增加,TGEV组只在3 h时显著刺激IL-6 m RNA表达量增加,枯草芽孢杆菌组只在1 h时显著刺激IL-6 mRNA表达量增加,并达到最大值,且均低于BS+Cell+TGEV组。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.65

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本文编号：1331440