屎肠球菌HDRsEf1调节IPEC-J2细胞炎症反应机制研究

发布时间：2017-12-30 00:05

  本文关键词：屎肠球菌HDRsEf1调节IPEC-J2细胞炎症反应机制研究　出处：《华中农业大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：屎肠球菌是公认的益生乳酸菌,具有改善宿主肠道健康、促进生长、降低腹泻及免疫调节等作用。目前,有关屎肠球菌益生机理研究较少,尤其是其炎症调节机制。本论文通过体外试验,研究屎肠球菌HDRsEf1菌株对IPEC-J2细胞炎症反应调节机制。主要的研究内容和结果如下:试验1屎肠球菌HDRsEf1对IPEC-J2细胞的影响。(1)粘附试验。分别将HDRsEf1或者产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic e.coli,ETEC)K88ac与培养10天后的IPEC-J2细胞共孵育,检测各自的粘附率。接下来检测HDRsEf1菌体和其培养上清对K88ac粘附的影响。实验过程如下:IPEC-J2细胞与HDRsEf1和K88ac共孵育,或者IPEC-J2细胞先与HDRsEf1共孵育,再与K88ac共孵育,或者IPEC-J2细胞先与K88ac共孵育,再与HDRsEf1共孵育,分别检测K88ac的粘附率。HDRsEf1培养上清(S-Ef1)对K88ac粘附的影响的操作和菌体类似。结果显示HDRsEf1比K88ac更易粘附于IPEC-J2细胞,且HDRsEf1菌体能够通过竞争、排斥和置换作用阻止K88ac粘附IPEC-J2细胞,其粘附抑制率分别为46%(P0.05),11%(P0.05),61%(P0.05),表明HDRsEf1置换致病菌的效果较好。此外,实验证明S-Ef1对K88ac的粘附几乎没有影响。(2)屎肠球菌HDRsEf1对IPEC-J2细胞完整性的影响。IPEC-J2细胞培养10天后,能够分化完全,形成完整的膜结构,可以开始试验。首先,我们用HDRsEf1及其S-Ef1预处理细胞2h,之后更换新鲜的完全培养基,再加入K88ac,在3、6、12h测量其跨膜电阻(TEER)。结果显示HDRsEf1及其S-Ef1能够保护IPEC-J2细胞膜结构的完整性,并能缓解K88ac对IPEC-J2细胞膜结构的破坏。(3)屎肠球菌HDRsEf1对IPEC-J2细胞分泌IL-8的调节作用。首先,用HDRsEf1及其S-Ef1预处理细胞2h,之后更换新鲜的完全培养基,再加入诱炎因子K88ac、IL-1β、TNF-ɑ处理细胞,之后检测IL-8的表达,结果发现HDRsEf1及其S-Ef1都能够缓解诱炎因子K88ac、IL-1β、TNF-ɑ诱导的IL-8的表达。为了了解HDRsEf1发挥炎性调节作用的成分,将HDRsEf1及其S-Ef1加热处理,并将其提取S-Ef1中的蛋白和胞外多糖,然后进行抑炎试验。首先分别用灭活HDRsEf1、灭活S-Ef1、S-Ef1中蛋白、胞外多糖预处理IPEC-J2细胞2h,之后加入K88ac作用2h。结果表明热处理对HDRsEf1及S-Ef1的抑炎效果没有影响,S-Ef1中的胞外多糖具有抑炎作用,而S-Ef1中的蛋白没有抑炎作用。试验2屎肠球菌HDRsEf1胞外多糖的分离纯化。试验证明HDRsEf1具有产胞外多糖的性能,将HDRsEf1接种在脱脂乳培养基中30oC培养30h,其精提胞外多糖产量可达320mg/m L左右。将粗提胞外多糖用DEAE-Toyopearl 650M离子交换层析分离得到中性多糖(NPS)和酸性多糖(APS),将NPS和APS分别经过Sephadex G-100和Sepharose CL-6B纯化,得到纯的NPS和APS。试验3 HDRsEf1及其胞外多糖调节IPEC-J2细胞炎症反应信号通路研究。首先检测HDRsEf1及其胞外多糖对细胞的毒性作用,证实HDRsEf1及其两种多糖对IPEC-J2细胞没有毒性,且都能提高IPEC-J2细胞的活性。接着,验证HDRsEf1及其两种多糖的炎症调节作用,结果显示HDRsEf1及其两种多糖都能缓解LPS诱导的肠上皮细胞的炎性反应。接下来,试验HDRsEf1及其两种多糖是否通过TLR2和TLR4两种受体发挥抑炎作用,以LPS诱导IPEC-J2炎症模型,采用抗体中和试验TLR2和TLR4在HDRsEf1及其两种多糖在炎症调节中的作用,结果显示,TLR2在HDRsEf1的炎症调节中起重要的作用;TLR2和TLR4在两种多糖的炎症调节中都发挥重要的作用。为进一步弄清HDRsEf1及其两种多糖对TLR的炎症调节机制,检测了HDRsEf1和其两种多糖对TLR信号通路中相关负调节因子表达的影响。结果显示TLR负调节因子Tolliop,IRAKM,A20,Bcl-3在HDRsEf1的炎性调节中起重要的作用;TLR负调节因子SIGIRR,Tolliop,IRAKM,A20,Bcl-3在NPS的炎性调节中起重要的作用;TLR负调节因子Tolliop,A20,Mkp-1在APS的炎性调节中起重要作用。最后用Western Blot检测了HDRsEf1和其两种多糖对NF-κB、AP-1两种核转录因子的影响,结果表明HDRsEf1、NPS、APS能够通过调节NF-κB、AP-1的活性从而起到炎性调节的作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.6

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本文编号：1352444